Ниже приводятся оптимальные условия промышленного культивирования Bacillus subtilis.
Культивирование Bacillus subtilis
Культура Bacillus subtilis – 65 выращивается в пробирках на агаризованной среде в термостате при 37ºС в течении одних суток. Посев производится уколом в глубину питательной среды. Далее культура культивируется на качалках в колбах объемом 750 мл. При температуре 37ºС 46 часов, частота движения качалки 180-200 об/мин. В качестве среды используется производственная. После культура подается на стадию инокуляции. Процесс проходит при следующих условиях: температура 37ºС, избыточное давление 0,1 МПа, расход воздуха 258 м3/час, время 48 часов. После инокуляции маточный раствор стерильно подается в два параллельных ферментатора, где непосредственно производится процесс культивирования. Условия ферментации следующие: температура 37ºС, избыточное давление 0,1 МПа, расход воздуха 2580 м3/час, время ферментации 72 часа. После чего культуральная жидкость подается в сборник для дальнейшей очистки.
Стерилизация питательной среды и воздуха для культивирования Bacillus subtilis
Стерилизацию питательной среды проводят автоклавираванием при температуре 127ºС в течении 20 минут, затем охлаждают до 36 – 38 ºС и подают в ферментаторы и инокулятор. Атмосферный воздух с помощью вентилятора закачивается в воздушный фильтр, далее поступает в общий фильтр бактериальный фильтр, где очищается от основной массы бактерий и перед подачей в ферментер проходит через индивидуальный воздушный фильтр, где происходит его окончательная очистка.
Стадии очистки и выделения фермента альфа амилазы из культуры Bacillus subtilis
Культуральная жидкость из сборника готовой культуры подается на фильтр, где освобождается от биомассы бактерий, которая в последствии инактивируется. Фильтрат культуральной жидкости осаждается ацетоном (в соотношении 1: 2) и центрифугируется (5000 об/мин). Образовавшийся осадок амилаз растворяют в воде при температуре 55-60ºС, после чего фильтруют. Фильтрат обрабатывают гелем фосфата кальция и охлаждают в течении 2 часов, а затем центрифугируют. Фугат, для удаления балластных веществ обрабатывают ацетоном (в соотношении 1: 1,5) и проводят центрифугирование, отбрасывая образовавшийся осадок. Процедуру повторяют два раза. Далее фугат разбавляют в два раза водой, осаждают ацетоном и центрифугируют. Образовавшийся осадок хроматографически очищают на сефадексе G – 25 и осаждают ацетоном (в соотношении 1: 4). Осадок измельчают до размеров частиц не более 1-2 мм и сушат в распылительной сушилке при температуре 40±2ºС в течении 5-8 минут. Высушенный препарат альфа – амилазы направляют на упаковку.
Автор статьи: ст. гр. БТ, УГХТУ, Кириченко К.
На фото культура Bacillus subtilis.