Исследование растительных источников получения фермента уреазы аналитического назначения
Одним из перспективных направлений в биотехнологии является промышленная энзимология. Данное направление предусматривает не только масштабное получения промышленных ферментных препаратов, но и разностороннее использование ферментов [1]. Промышленные ферментные препараты обладают как техническим, так и пищевым и медицинским назначением. Кроме того, ферменты все шире применяют для аналитических целей. Так фермент уреазу используют для качественного определения мочевины в различных биологических жидкостях, например, в слюне, крови и других [2, 3, 4, 5]. Фермент уреаза, согласно Международной классификации ферментов, относится к третьему классу ферментов — класса гидролаз, подклассу амидаз, подподкласс карбамидаз, кодовый номер фермента уреазы 3.5.1.5 [6].
По уровню специфичности уреаза относится к группе ферментов с абсолютной субстратной специфичностью, т.е. катализирует гидролиз только мочевины.
В ходе углубленного изучения фермента и при использовании высокоочищенных субстратов было обнаружено, что уреаза гидролизует также небольшое количество производных мочевины: N-оксимочевину, семикарбазид, N, N-диоксимочевину, но не гидролизует карбазид (N, N-диаминомочевину), N-метилмочевину, N-бутилмочевину, N-метоксимочевину, имидазолидинон, биурета, 1-фенилсемикарбазид, этилкарбамат, карбамоилазид [7].
Но поскольку уреаза имеет практически абсолютную специфичность в отношении мочевины, то возможно использование данного фермента для аналитического определения именно мочевины. Для аналитических целей фермент уреазу необходимо получать в определенной товарной форме, т.е. в виде готового ферментного препарата. В настоящее время в Украине препарат уреазу не производят. Таким образом, для промышленного получения фермента необходимо подобрать определенное сырье. В целом, для выделения ферментов, возможно использовать сырье различного происхождения: микробного, растительного или животного [1]. Для получения уреазы подходит только микробное и растительное сырье. В тканях животных и человека фермент уреаза не синтезируется. Наличие уреазы в некоторых биологических жидкостях, например, в слюне, объясняется присутствием в ней соответствующих микроорганизмов, вырабатывающих и выделяющих данный фермент.
Микробиологический синтез уреазы целесообразен, но экономически оправдан для крупнотоннажного производства. Для специальных и аналитических целей в настоящее время, нужно не сколько количество, сколько качество получаемого ферментного препарата уреазы.
Таким образом, наиболее подходящей исходным сырьем для получения качественных препаратов фермента уреазы является растительное сырье. Известно, что уреаза содержится в тканях многих высших растений. Но особенно много фермента проявляется в бобовых растениях, а также в семенах кабачков, арбузов [8].
Из выше изложенного следует, что целью данной экспериментальной работы является изучение и подбор растительного сырья для выделения фермента уреазы, предназначенного для определения мочевины в биологических жидкостях. В данной работе изучены следующие виды потенциально возможного растительного сырья, как соя, бобы конские и бобы черные американские.
Сокращенная характеристика видов следующая.
Культурная соя (Glycine Max) – однолетнее растение, которое появилось в Восточной Азии. Анализ генетической структуры по биохимическим маркерам дает показания о большой чистоте сортов данной культуры. У растений Glycine Max методом электрофореза обнаружены быстрые и медленные варианты уреазной активности. Они контролируются одним локусом (EuS). Молекулярная масса медленного варианта в два раза больше, чем быстрого.
Конские бобы (Vicia faba, Faba vulgaris) – также растения семейства бобовых. Плод — боб с 2-4-мя зернами и более. Конские бобы самоопыляющиеся растения, но редко бывает перекрестное опыление, очень любят влагу.
Черные американские бобы или канавалия (Canavalia) – относятся к семейству бобовых. Это быстрорастущее многолетнее растение, но является проблемным для сельскохозяйственного культивирования в Украине [8].
Материалы и методы
Для экстракции фермента уреазы с указанного растительного сырья использовали известные биохимические методы [9,10,7].
Основные операции метода — это измельчение бобов, обезжиривание измельченного сырья с помощью эфира, высушивание, экстракция фермента с подготовленного сырья. Как экстрагент использовалась вода, которая является хорошим растворителем для многих белков и ферментов. Данный метод позволяет провести качественную проверку активности выделенного фермента, которая основана на обнаружении образованного аммиака с помощью спиртового раствора фенолфталеина или с помощью реактива Несллера [9].
Для предварительного определения активности уреазы использовали упрощенную методику [11], которая предусматривает экстракцию фермента подкисленной водой. Для количественного определения активности уреазы в растительном сырье использовали другой метод [7], которая предусматривает построение калибровочного графика. Полученные в работе экспериментальные данные обрабатывали с применением методов математической статистики [12,13].
Результаты и их обсуждение
Для исследования были выбраны образцы семян урожая 2007-2008 годов. Сортовая принадлежность семян и условия выращивания не устанавливались. Для определения активности уреазы в исходном сырье использовали простую методику экстракции фермента, которая указана выше. Активность уреазы в исследуемых образцах рассчитывали в сравнении с эталонным образцом-стандартом уреазы производства фирмы Сигма, который имеет активность 250 ед / мг.
Таблица 1 — Содержание уреазы в семенах бобовых растений
| Источник уреазы | Год урожая | Средняя активность, ед/мг |
|---|---|---|
| Соя | 2007 | 10,3±0,01 |
| Соя | 2008 | 15,4±0,01 |
| Черные бобы | 2007 | 5,2±0,01 |
| Черные бобы | 2008 | 8,3±0,01 |
| Конские бобы | 2007 | 3,5±0,01 |
| Конские бобы | 2008 | 4,1±0,01 |
Полученные результаты приведены в табл. 1, из которой видно, что содержание уреазы в изученных образцах сои намного выше, чем у черных и конских бобов в семенах, как 2007, так и 2008 года урожая. Можно отметить также, что содержание уреазы в семенах урожая 2007 года ниже, чем в 2008 году, затем вопрос о том, является ли это следствием снижения активности уреазы при длительном хранении семян или зависит от погодных условий при выращивании, требует дополнительного изучения.
В данной работе предложена также оптимизированная схема выделения фермента уреазы из семян бобов. В связи с этим, выделение уреазы проводили по двум схемам: по известной методике и по предложенной методике. Последовательность операций в каждой из схем показана на рисунке.
Схемы выделения фермента уреазы: а — известная методика, б — предложена методика
Был проведен сравнительный анализ эффективности стадий выделения уреазы по указанным методикам. А также изучена возможность использования обезжиренной пищевой муки сои для выделения фермента. Для этого определили удельную активность уреазы на стадии получения сухого обезжиренного порошка из сои перед экстракцией дистиллированной водой. Полученные результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2 – Сравнительный анализ эффективности различных схем выделения уреазы из муки бобов
| Схема выделения (источник) | Средняя активность уреазы, ед/мг |
|---|---|
| Лабораторная схема | 12,5±0,01 |
| Разработанная схема | 10,7±0,01 |
| Пищевая соевая мука | 0,5±0,01 |
Как видно из табл. 2 использование известной методики обеспечивает выделение фермента с более высокой активностью. Объясняется это, очевидно, более тщательным измельчением сырья. Так согласно лабораторному методу, кроме измельчения в мельнице, проводилось дополнительное растирания сырья в фарфоровой ступке.
Кроме того, как свидетельствуют данные табл. 2, из пищевого соевой муки выделяется фермент с довольно низкой активностью 0,5 ед / мг. Таким образом, пищевая соевая мука, как натуральный источник сырья, не пригодная для промышленного получения препарата уреазы.
Для проведения полного сравнительного анализа двух исследуемых методик использовали черные и соевые бобы. Конские бобы, показавшие в предыдущем опыте низкую активность фермента, не использовали. В обоих случаях уже в конечных образцах, выделенных препаратов, определили как количество фермента, так и его активность. Полученные результаты представлены в табл. 3 и свидетельствуют, что известная лабораторная методика обеспечивает больший выход фермента. Так конечный выход уреазы, полученный по известной лабораторной схеме, практически на порядок выше, чем по предложенной схеме. Но количественная зависимость по активности выделенного фермента обратная.
Таблица 3 – Сравнительный анализ схем выделения и источники уреазы
| Источник уреазы | Схемы выделения | Средний конечный выход уреазы, г/кг | Средняя активность уреазы, ед/мг |
|---|---|---|---|
| Черные бобы | лабораторная | 1,2±0,01 | 30,3±0,01 |
| Черные бобы | разработанная | 0,1±0,01 | 100±0,01 |
| Соевые бобы | лабораторная | 3,3±0,01 | 20,5±0,01 |
| Соевые бобы | разработанная | 0,2±0,01 | 90,7±0,01 |
Препарат уреаза, полученный по предлагаемой схеме активен в 3,0-4,5 раза больше, чем активность фермента, выделенного в соответствии с лабораторной схемой. Установленные закономерности характерны для всех видов исследованного растительного сырья, и для черных и для соевых бобов. Очевидно, многократное фракционирования этиловым спиртом, предусмотренное предлагаемой схеме, позволяет получить уреазу с достаточно высокой степенью очистки — до 100 ед / мг.
Таким образом, в качестве исходного растительного сырья для промышленного получения ферментного препарата уреазы, могут быть рекомендованы семена изученных видов бобовых растений. Причем, преобладающим источником получения фермента являются соевые бобы, которые обеспечивают конечный выход уреазы в три раза больше, чем черные бобы. Данная закономерность характерна для обеих схем выделения фермента.
Кроме того, соя, в отличие от черных бобов, является распространенной и широко культивируемой сельскохозяйственной культурой в Украине. Итак, потенциальное исходное сырье на основе соевых бобов является недорогим, доступным, недефицитным для отечественного рынка по сравнению с черными бобами.
Недостатком соевых бобов, как возможного источника получения фермента, следует считать то, что уреаза, выделенная из соевых бобов имеет низкую активность, чем уреаза, полученная из черных соевых бобов. В таком случае, для выделения фермента из соевых бобов с высшей активностью рекомендуется использовать вторую схему выделения фермента, а именно схему, которая предложена и разработана в данной работе. Для повышения же активности полученного фермента уреазы, предназначенного для аналитических целей, следует проводить дальнейшую очистку препарата различными методами, которые не инактивируют фермент.
Список литературы
- Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. – М.: Высш. шк., 2001. – 384 с.
- Храмов В.А., Папичев Н.В., Штепа Л.И. Обнаружение фермента уреазы в слюне человека // Химия в школе. – 2003. – № 7. – С.57-59.
- Биотехнологиямикробных ферментов / А.Г. Лобанок, Н.И. Астапович, Р.В. Михайлова и др. –Минск: Наука и техника, 1989. –205с.
- Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеренбург: Уральский рабочий, 1994. – 384 с.
- Мардашев С.Р. Биохимические проблемы медицины. – М.: Высш. шк., 1975. – 310 c.
- Строев Е.А. Биологическая химия: Учебник для фармац. мед. институтов. – М.: Высш. шк., 1986. – 479 с.
- Шевряков М.В., Яковенко Б.Я., Явоненко О.Ф. Практикум з біологічної хімії: Навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей і факультетів фізичного виховання і спорту вищих навчальних закладів. – Суми: Ун-т. кн., 2002. – 204 с.
- Методы биохимического исследования растений / А.И.Ермаков,В.В. Арасимович, М.И. Смирнова-Иконникова,И.К. Мурри. – М.-Л.: Государственное изд-во сельскохозяйственной лит., 1952. – 520 с.
- Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. – М.: Просвещение, 1982. – 311 с.
- Средства индивидуальной защиты / С.Л. Каминский,К.М. Смирнов,В.Ч. Жуков, Н.А. Краснощеков. – Л.: Химия, 1989. – 400с.
- Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – Ростов-на-Дону: Феникс, 1999. – 544 с.
- Румынский Л.З. Элементы теории вероятностей. – М.: Наука, 1970. – 256 с.
- Цветков В.Н. Математическая теория эксперимента (пассив. эксперимент). –Днепропетровск: изд-во. ДНУ, 1979. – 110с.
Источник: Зубарева І.М. Дослідження рослинних джерел отримання ферменту уреази аналітичного призначення / Зубарева І.М., Гейсун А.А., Вакуліч А.М., Савченко М.П. // Вопросы химии и химической технологии. – 2010. – № 3. – С.49-52.