Blakeslea trispora — оптимизация питательной среды для глубинного культивирования промышленного продуцента бета-каротина

Опубликовано: 26 ноября 2012 | Статьи по биотехнологии

Оптимизация питательной среды для глубинного культивирования промышленного продуцента бета-каротина микроскопического гриба Blakeslea trispora

Каротиноиды используются в пищевой промышленности для обогащения кисломолочных, хлебобулочных, кондитерских, масложировой продуктов и напитков и как пигментные вещества и красители [Петрова, 2004дис.]; В фармации при изготовлении лекарств и косметических средств [2116778, 1998Пат., Автушенко; Сотрясение, 2007]; в медицинской практике для профилактики и лечения ряда заболеваний [2137471, Пат.1999, Гаврилов] и в сельском хозяйстве для сохранения и повышения поголовья и улучшения товарных качеств мяса [Примова, 2002; Божко 2008]. К каротиноидам, широко применяемым, относятся бета-каротин и ликопин. При гидролизе бета-каротина высвобождается две молекулы витамина А (ретинол), играющего важную физиологическую роль. Самостоятельно, бета-каротин способствует остроте зрения, процессам роста и развития организма как человека так и животных. Также, бета-каротин является природным антиоксидантом [Петрова, 2004дис.].

Каротиноиды получают с помощью химического синтеза [2074177, Ковсман, Пат.1997; 2152929, Пат.2000, Белова] и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов [2177505, 2001ПАТ., Кунщикова-блакеслеа; Петрова, 2004дис.-раститет. порошок; Постоенко, 2003дис.-морковь]. Синтетические каротиноиды не обладают функциональными свойствами, относительно усвоения и лечебного эффекта, в отличие от натуральных, и наоборот, могут приводить к аллергическим заболеваниям [Мартиновский, 2003]. Получения каротиноидов из растений, также, имеет ряд недостатков: носит сезонный характер; зависит от экологического состояния почв и урожаев растений, которые существенно снижаются благодаря распространению фитопатогенной микрофлоры; существует потребность больших посевных площадей под выращивание растений. К тому же, биодоступность каротиноидов из сока овощей невелика, из-за наличия каротиноидов в составе белковых комплексов, что значительно затрудняет их высвобождение. Усвоение каротина из овощей, при диете без жиров, очень низкое. «Микробиологические» каротиноиды, включая бета-каротин, получают из клеток мицелиальных грибов, дрожжей, бактерий, актиномицетов и водорослей [Каминский, 2004стат или 2005 дис.-дрожжи; Примова 2008-блакеслеа]. Грибы имеют большое значение как продуценты различных биологически активных веществ для пищевой промышленности, медицины, сельского хозяйства и других отраслей. Не исключение и микроскопический гетероталлический гриб Blakeslea trispora, который является промышленным продуцентом каротиноидов, включая бета-каротин и ликопин [Деев, 2002; Кричковская, 2007; Примова 2008; Терешина, 2010]. Во время биосинтеза каротина микроорганизмами, он накапливается в клетках продуцента. Собственные жиры грибу Blakeslea trispora составляют до 60% всей биомассы, что способствует растворению каротина в процессе накопления мицелия гриба. Это соответственно повышает его доступность для усвоения, например при скармливании кормового препарата микробиологического каротина животным. Технология получения микробиологических каротиноидов является экологически чистой, из-за отсутствия вредных выбросов и применения неагрессивных химических веществ. Исходным сырьем в микробиологическом производстве появляются доступные и не ценные побочные, промежуточные продукты и отходы крахмало-паточного производства, мукомольной, консервной, масляной и мясомолочной промышленности. Поэтому, микробиологический синтез каротиноидов является единственным целесообразным путем промышленного синтеза данных пигментов.

Глубинное культивирование на жидких питательных средах является промышленным способом, при создании полностью контролируемых условиях, получения биомассы Blakeslea trispora [Кричковская, 2007]. Основными факторами, влияющими на процесс каротинообразования являются состав питательной среды и качество применяемых штаммов [Зубарева, 2001]. Существующие исследования направлены на получение новых высокопроизводительных пар штаммов культуры гриба Blakeslea trispora [Кудинова, 2003] и на разработку новых, относительно дешевых и простых питательных сред [Кудинова, 2003; Примова 2008]. Грибы, как гетеротрофные организмы, используют для пластического и энергетического обменов различные органические источники азота – белки, пептиды, аминокислоты, а также неорганический азот аммиака, аммонийных солей, нитратов, нитритов. Степень использования различных источников азота зависит от условий культивирования, возраста культуры, направленности биосинтетических процессов [Примова 2008]. Состав питательной среды влияет на ход биосинтетических процессов в клетках микроорганизмов, а следовательно и на химический состав конечной биомассы и соответственно биотехнологических продуктов, которые производятся на ее основе. Следовательно, актуальным является поиск питательных сред, применение которых не только бы удешевляло, но и оптимизировало процесс каротиногенеза и увеличивало выход каротина. В связи с этим целью данной работы является разработка и оптимизация питательных сред на основе гидролизатов крахмалосодержащих компонентов и глютена в качестве источника азота для выращивания гриба Blakeslea trispora.

Материал и методика исследований

В данных опытах использовали смешанную культуру мукорового гриба Blakeslea trispora. Для опытного культивирования применяли среды, которые вмещали в качестве источника углерода ферментные гидролизаты побочных продуктов переработки ржи и овса, в качестве источника азота отходы крахмалопаточного производства – глютен. Для приготовления контрольных сред использовали другие отходы крахмалопаточного производства – зеленую патоку и кукурузный экстракт в качестве источников углерода и азота соответственно. Выращивание грибной биомассы проводили по стадийно.

(+) И (–) 8 А штаммы музейной культуры Blakeslea trispora сохраняются на сусло-агаровой среде раздельно. Рабочую культуру получают путем пересева обоих штаммов также раздельно на сусло-агаровые или агаризованные экстрактно-паточной среды в микробиологические пробирки, которые затем выдерживают в термостате при температуре 24-260С в течение 7 суток. Маточную культуру Blakeslea trispora также получают раздельным пересевом обоих штаммов на жидкую питательную среду в качалочные колбы объемом 250 мл, с последующим выращиванием в условиях перемешивания в течение 5 суток. Маточное среда содержит кукурузный экстракт – 13% и зеленую патоку – 7%. Ферментация предусматривает совместное культивирование (+) и (–) форм продуцента Blakeslea trispora на жидких питательных средах в течение 7 суток, при температуре 26-280С и режиме перемешивания 200-240 об / мин на микробиологических термостатных качалках УВМТ-12-250 в колбах емкостью 250 мл, с объемом питательной среды 50 мл.

Контрольная ферментационная среда вмещала 6% кукурузного экстракта, что соответствует 0,24%-й концентрации азота и 5% зеленой патоки, что соответствует 0,15%-й концентрации углеводов. Для приготовления опытных сред использовали в качестве источника углерода жидкие ферментные гидролизаты побочных продуктов мукомольной промышленности (ржаные или овсяные) в объемных концентрациях 38; 13; 4%, что соответствует концентрациям сахаров 1,50; 0,50; 0,15% соответственно.

Для обработки крахмалосодержащих отходов применяли отечественные промышленные ферментные препараты микробного происхождения «Альфалад БН» (α-амилаза Гх-466) и «Глюколад» (глюкоамилаза ГЗХ-1) Ладыжинского завода. Выбор препаратов связан с известной спецификой их действия на углеродные компоненты. Препарат амилолитического действия – альфа-амилаза (1:1000, активность 1900 ед / мл) расщепляет альфа-1 ,4-глюкозидные связи с образованием нормальных альфа-декстринов, глюкозы, мальтозы. Глюкоамилаза (1:200, активность 5800 ед / мл) расщепляет альфа-1, 4 — и α-1 ,6-глюкозидные связи с образованием глюкозы в качестве продукта гидролиза.

В качестве источника азота использовали глютен с объемными концентрациями 20; 30; 40%, что соответствует концентрациям азота 0,16; 0,24; 0,32%. Контрольные и исследуемые среды также вмещали 0,05% KH2PO4, 2% кукурузного масла, рH = 6,9-7. Таким образом, концентрация азота в контрольной среде (6% кукурузного экстракта) и изучаемых средах с глютеном (30%) одинаковая и составляет 0,24%.

По окончании ферментации биомассу грибу Blakeslea trispora, отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3000 об / мин. течение 10 минут на центрифуге Т-23. Сырую биомассу гриба Blakeslea trispora высушивали при температуре 1050С до постоянного веса. Количество повторов исследования составила 10. Полученные результаты обрабатывали методом математической статистики [Фролова, 2010].

Результаты и их обсуждение

Предложенная питательная среда требует оптимизации по содержанию качества источников как углерода (ферментные гидролизаты), так и источников азота (глютен). То есть, необходимо выявить такие концентрации изучаемых компонентов среды, которые обеспечивали б больший выход как биомассы продуцента Blakeslea trispora, так и бета-каротина. В опытную питательную среду, содержащую 30% глютена вносили овсяный и ржаной гидролизаты с различными концентрациями сахаров. Выбрана концентрация глютена была установлена в отдельном исследовании.

Таблица 1 – Определение оптимальной концентрации сахаров в средах с ферментными гидролизатами и 30%-ым содержанием глютена

Источники углерода и азота

Концентрация сахаров, %

Количество сухой биомассы, г/100 мл*

Количество бета-каротина, г/100 мл*

Контроль

0,15

1,476±0,073

0,528±0,026

Овсяный гидролизат

1,5

2,572±0,128

1,000±0,050

0,5

2,338±0,116

1,250±0,062

0,15

1,764±0,088

0,607±0,030

Ржаной гидролизат

1,5

2,470±0,123

0,862±0,043

0,5

2,581±0,129

1,269±0,063

0,15

1,892±0,094

0,626±0,031

* – данные представлены в виде x ± m*t0.05, где x – среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического, t0.05 – коэффициент Стьюдента на уровне значимости 0,05.

Все варианты исследуемой питательной среды обеспечили увеличение количества биомассы и бета-каротина грибом Blakeslea trispora по сравнению с контролем. На средах с овсяными и ржаными гидролизатами наблюдается общая тенденция. Гидролизаты с концентрацией сахаров, аналогичной концентрации сахаров в контрольной среде – 0,15% вызывают незначительный прирост биомассы Blakeslea trispora и накопления бета-каротина. Следовательно, можно сделать вывод, что 0,15% концентрация сахаров маловата для развития гриба Blakeslea trispora, независимо от качественного состава среды. Различия между количеством сухой биомассы гриба Blakeslea trispora на обоих видах гидролизных сред с концентрациями сахаров 0,5% и 1,5% оказались не достоверными. Накопление бета-каротина преобладало на средах с концентрацией сахаров в гидролизатах 0,5%, независимо от вида продуктов переработки муки. На обоих видах гидролизатов с 0,5% концентрацией сахаров наблюдалось увеличение мицелиальной массы примерно в 1,7 раз по сравнению с контролем.

Другие закономерности обнаружены в накоплении бета-каротина продуцентом на опытных средах. Так, большее количество сахаров (1,5%) в среде подавляет синтез каротиноидов относительно 0,5% сахаров. Количество целевого продукта при 0,5% растет в 1,4 раза по сравнению с 1,5% концентрацией, а по сравнению с контролем почти в 2,5 раза. Выявленные закономерности характерны для обоих видов исследуемых гидролизатов.

Следовательно, на развитие гриба Blakeslea trispora и на накопление вторичного метаболита бета-каротина одинаково положительно влияют ржаные и овсяные ферментные гидролизаты. Оптимальной концентрацией сахаров для накопления биомассы Blakeslea trispora и бета-каротина являются 0,5% концентрация с одновременным применением 30%-го глютена в качестве источника азота, вызывающий прирост биомассы в 1,7 раз, бета-каротина почти в 2,5 раза.

Учитывая отсутствие достоверных различий в развитии гриба и накоплении бета-каротина на средах с овсяными и ржаными гидролизатами исследования по определению оптимального количества глютена в качестве источника азота проверяли на среде с применением овсяных гидролизатов.

Таблица 2 – Определение оптимальной концентрации глютена в питательных гидролизных средах с 0,5% концентрацией сахаров

Источники углерода и азота

Концентрация глютена, %

Количество сухой биомассы, г/100 мл*

Количество бета-каротина, г/100 мл*

Контроль

–

1,476±0,073

0,528±0,026

Овсяный гидролизат и глютен

20

1,316±0,065

0,432±0,021

30

2,338±0,116

1,250±0,062

40

1,924±0,096

0,625±0,031

Концентрация глютена 20%, что соответствует концентрации азота 0,16% оказалась недостаточной, и даже меньше чем контроль, для накопления биомассы гриба и вторичного метаболита бета-каротина. При применении 40% концентрации глютена отмечено снижение количества биомассы Blakeslea trispora до 20%, а бета-каротина до 50%, по сравнению с 30% концентрацией глютена, что может быть связано с ухудшением массообмена в культуральной жидкости из-за его вязкой консистенции. Таким образом, установлено, что применение глютена в концентрациях меньше и больше 30% не обосновано. Несмотря на то, что концентрация азота в контрольную среде (6% кукурузного экстракта) и исследовательских средах с глютеном (30%) одинакова и составляет 0,24%, лучший прирост биомассы продуцентуBlakeslea trispora на накопление бета-каротина наблюдался на опытной среде. Так на развитие продуцента влияет не только количественный состав, но и качественный. Так целесообразнее применять 30%-ый глютен вместо 6%-го кукурузного экстракта, что дает прирост биомассы продуценту в 1,6 раз больше и повышает накопление каротина примерно в 2,4 раза.

Выводы

Таким образом, для промышленного использования можно предложить применение глютена с концентрацией 30% в качестве источника азота, при одновременном применении гидролизатов побочных продуктов овсяной или ржаной муки, с концентрацией сахаров 0,5%, что дает возможность получать сухую биомассу гриба Blakeslea trispora в количестве примерно 23-26 г / л и бета-каротин – 13 г / л. Результаты исследований показали возможность увеличения количества биомассы путем оптимизации питательной среды для глубинного культивирования промышленных штаммов гриба Blakeslea trispora. Перспективы последующих исследований в данном направлении заключаются в дальнейшей оптимизации среды путем применения другого крохмалсодержащего сырья в качестве источника углерода.

 

Список литературы

  1. Патенты по микологии «Blakeslea trispora»
  2. Божко Наталія Володимирівна. Удосконалення технології вирощування норок з використанням препаратів мікробіологічного синтезу гриба Blakeslea trispora: Дис… канд. наук: 06.02.04 / Херсонський державний аграрний університет. – Херсон, 2008. –   с.
  3. Деев С. В. Разработка технологии получения жирорастворимых биологических активных веществ из биомассы гриба Blakeslea trispora: Дис… канд. техн. наук: 05.18.10. – М.: 2002. – 186 c.
  4. Зубарева И. М.Влияние отдельных органических кислот на метаболизм каротинсинтезирующего гриба Blakeslea trispora / И. М. Зубарева, О. В. Кузнецова // Вісник ДНУ. Сер. Біологія. Екологія. – 2001. – Т.9. – № 1 – С.184-186.
  5. Камінська М. Каротинсинтезуючі дріжджі Phaffia rhodozyma / М. Камінська, Л. Сологуб // Вісник львів. Ун-ту. Сер. біол., 2004. – Вип. 37. – С. 3-12.
  6. Камінська Марта Володимирівна. Каротиногенез у різних штамів дріжджів Phaffia rhodozyma та їх застосування у живленні курей-несучок: дис… канд. с.-г. наук: 03.00.04 / УААН; Інститут біології тварин. – Л., 2005. – 144 c.
  7. Кричковская Л. В. Оптимизация синтеза натурального провитамина биомассой микрогриба / Л. В. Кричковская, О. Е. Струс, Н. П. Половко // Вестник фармации, 2007. – Т. 36. – № 2. – С. 1-5.
  8. Кудинова С. П. Разработка технологии получения и фармако-токсилогические исследования бета-каротина: Дис… докт. биол. наук: 03.00.23. – Краснодар: 2003. – 303 c.
  9. Мартиновський Валерій Павлович. Перетравність корму, обмін речовин, продуктивність та якість м’яса курчат – бройлерів при згодовуванні біомаси гриба Blakeslea trispora: Дис… канд. с.-г. наук: 06.02.02 / Національний аграрний ун-т. – К., 2003. – 134 с.
  10. Математичне моделювання та оптимізація об’єктів технології неорганічних речовин / Л.А. Фролова, Б.І. Мельников, Ю.Д. Галівець, Н.Б. Мітіна. – Дніпропетровськ: Журфонд, 2010. – 208 с.
  11. Петрова Жанна Олександрівна. Розробка процесів одержання каротиновмісних харчових продуктів: Дис… канд. техн. наук: 05.18.12 / Інститут технічної теплофізики НАН України. – К., 2004. – 218 с.
  12. Постоєнко Олена Михайлівна. Екологічні характеристики культурних і дикорослих каротиноносних рослин – накопичувачів вірусів та ксенобіотиків і метод отримання з них каротину: Дис… канд. біол. наук: 03.00.16 / Київський національний ун-т ім. Тараса Шевченка. – К., 2003. – 120 c.
  13. Прімова Людмила Олександрівна. Хімічний склад препаратів каротину вітатону і вітадепсу та їх вплив і деякі показники обміну речовин в організмі курей в постнатальному онтогенезі: Дис… канд. біол. наук: 03.00.04 / Таврійський націон. Ун-т ім.. В. І. Вернадського. – Сімферопорль, 2002. –   с.
  14. Прімова Л. О. Особливості азотистого складу біомаси мукорового гриба Blakeslea trispora / Л. О. Прімова, Висоцький І. Ю. // Вісник СумДУ. Серія Медицина, 2008. – Т. 1. – №2. – С. 27-34.
  15. Струс И. Е. Применение каротина микробиологического в рецептуре солнцезащитного косметического крема / И. Е. Струс, Л. В. Кричковская, Л. В. Половко // Вестник фармации. – 2007. – № 2 (36). – С. 1-4.
  16. Терёшина В. М. Состав липидов у мукорового гриба Blakeslea trispora в условиях стимуляции ликопинообразования / В. М. Терёшина, А. С. Меморская, Е. П. Феофилова // Микробиология. – 2010. – Т. 79. – №1. – С. 39-44.
  17. Пат. 2074177 RU, МКИ C07C403/24. Способ получения бета-каротина / Е. П. Ковсман, К. А. Солоп, В. Д. Бательман, Г. И. Самохвалов, В. Л. Христофоров, Л. А. Вакулова, Т. А. Жидкова. – № 93035263/04; Заявл. 07.07.1993; Опубл. 27.02.1997.
  18. Пат. 2116778 RU, МКИ A61K7/00, A61K7/48. Косметическая композиция / С. С. Автушенко, Е. М. Сорокин. – № 95103239/14; Заявл. 03.03.1995; Опубл. 10.08.1998.
  19. Пат. 2137471 RU, МКИ A61K31/05, A61K31/07, A61K31/355, A61K38/02. Масляно-поливитаминный препарат/ А. С. Гаврилов, А. Ф. Ивакин, В. В. Зырянов. – № 96110771/14; Заявл. 28.05.1996; Опубл. 20.09.1999.
  20. 19.             Пат. 2152929 RU, МКИ C07C403/24. Способ очистки технического β-каротина / В. М. Белова; Т. И. Озорова; В. П. Беловодский; С. Н. Анакин; И. П. Серпуховитин; Г. Б. Гвоздев; Д. В. Давыдович; А. Т. Кирсанов. – № 99115385/04; Заявл. 12.07.1999; Опубл. 20.07.2000.
  21. Пат. 2177505 RU, МКИ C12P23/00, C12N1/14, C12N1/14, C12R1:645. Пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora КР 74+ и КР 86—, продуцирующая бета-каротин / И. С. Кунщикова (UA); Р. В. Казарян (RU); С. П. Кудинова (RU). – № 2000103831/13; Заявл. 15.02.2000; Опубл. 27.12.2001.

Авторы статьи: Зубарева И.М., к.т.н., доц. каф. биотехнологии и БЖД, УГХТУ; Ляпустина Е.В.

Автор фото в статье: Бондарь И.В.

 

Метки: , , , ,