Промышленное получение микробиологического β-каротина осуществляется с помощью гетероталлического гриба Blakeslea trispora. Процесс включает несколько последовательных стадий, на каждой из которых используют различные по составу питательные среды. В посевные и ферментационные среды обязательно следует вносить растительное масло в количестве 4%. Масло обеспечивает пеногашение в условиях глубинного культивирования и способствует каротинообразованию, являясь источником ненасыщенных жирных кислот, а также обеспечивает дополнительное углеводное питание продуцента. Таким образом, присутствие масла в производственных средах необходимо, но влияние масла на метаболизм гриба Blakeslea trispora исследовано недостаточно.
Изучение различных грибов, показало, что при наличии липидов в среде грибы синтезируют липазу – триацил глицеролацилгидролазу (Кл. ф. 3.1.1.3) [Сергеева 2010]. Липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (химической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты. Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Однако, внедрение липаз в производство ограничено их высокой стоимостью. Несмотря на множество работ, посвященных липазам, не достаточно полно охарактеризованы свойства и структура белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении [Янышева 2005].
Липиды мицелиальных грибов также представляют практическую ценность, в частности, рассматриваются как потенциальная основа получения альтернативных экономически более выгодных и экологических видов топлива – биодизельное топливо [Сергеева2008].
Внеклеточный фермент липаза является индуцибильным, то есть липолитическая активность грибов значительно возрастает в присутствии в среде специфических жировых веществ – индукторов. Как правило, подобными индуцибильными веществами выступают соответствующие компоненты среды. Наиболее эффективными индукторами липаз являются масла растительного и животного происхождения. Свободные жирные кислоты могут срабатывать как репрессоры ферментов липаз [Деев, 2002]. Предположительно, гриб Blakeslea trispora, подобно другим грибам, в присутствии растительного масла во внешней среде, также продуцирует внеклеточный фермент липазу, гидролизующий субстратное масло.
В связи с этим, целью данного исследования является изучение липолитической способности смешанной культуры продуцента β-каротина гриба Blakeslea trispora в условиях промышленного периодического глубинного культивирования.
Материалы и методы
Материалом исследования служили штаммы смешанной культуры гетероталлического гриба Blakeslea trispora: (–) 490 и (+) 64 (совместимые половые формы). На стадии получения посевного материала штаммы выращивали раздельно на сусло-агаре в пробирках при 26ºС в течение 7 суток. Затем проводили раздельное глубинное культивирование в маточных колбах, объемом 800 мл, на качалках при частоте перемешивания 220–240 об/мин и температуре 26–28ºС. Маточные среды содержали соевую и кукурузную муку, минеральные источники калия и витамин В1. Культивирование осуществлялось на протяжении 5 суток без добавления масла. Далее посевную культуру выращивали раздельно в посевных аппаратах, емкостью 2000 л, на жидких питательных средах, аналогичных маточным, но с добавлением растительного (подсолнечного) масла в количестве 48 г/л. Культивирование в посевных аппаратах длилось 2 суток до наступления экспоненциальной фазы развития продуцента.
Полученную (+) и (–) посевную культуру, находящуюся в состоянии активного роста, переносили в промышленный ферментер объемом 10 м3 для совместного выращивания на среде, содержащей кукурузный экстракт, зеленую патоку, 4% растительного масла, рН среды 6,5. Через двое суток от начала ферментации в культуральную жидкость вносят β-ионон и сантохин в качестве стимулятора каротиногенеза и антиоксиданта соответственно. Общая продолжительность ферментации 5 – 7 суток.
Так как растительное масло вносили в посевную и ферментационные среды, то для изучения липолитеческой активности продуцента из посевного и ферментационного аппаратов, стерильно, через определенные промежутки времени, отбирали пробы культуральной жидкости для анализа. Количество мицелиальной биомассы и содержание β-каротина определяли в соответствии с известными методиками [Терешина,1994]. Липолитическую активность оценивали по методу Ота и Ямаза [Васильченко, 1989] по разнице результатов титрования опытного и контрольного образцов. Результаты выражали в условных единицах: мл 0,01н КОН, пошедшего на титрование жирных кислот, образующихся в процессе гидролиза масла.
Опытная и контрольная смеси содержали по 2 мл культуральной жидкости и 9 мл эмульсии, в состав которой вошли (в г на 500 г) 83,5% подсолнечного масла, 194 г раствора поливинилового спирта, 222 г фосфатного буфера. Эмульсию готовили на смесительной установке «Воронеж» в течении 5 мин при 9 тыс. об/мин. Реакционную смесь после перемешивания выдерживали в термостате определенное время. Прерывали реакцию внесением 15 мл этанола. Жирные кислоты, образовавшиеся в процессе липолиза, титровали 0,01 н водным раствором КОН. Контрольные образцы титровали без выдерживания в термостате. Число повторов исследования составило 5. Полученные результаты обрабатывали методом математической статистики [Фролова2010].
Результаты и их обсуждения
В данной работе проверено влияние ряда факторов на активность внеклеточного фермента липазы продуцента β-каротина: температура, рН среды, длительность реакции. Для поставленных целей использовали смешанную 30-ти часовую культуру гриба Blakeslea trispora и 0,1 М фосфатный буфер. Полученные результаты приведены на рисунке 1 (а, б, в). Так, изменение липолитической активности рассмотрено в температурном интервале от от 15ºС до 50ºС при длительности выдержки в 1 час. Выявлено, что при повышении температуры от 15 до 30ºС активность фермента возрастает в 2,5 раза. При дальнейшем увеличении температуры, активность резко снижается, что можно объяснить инактивацией фермента липазы. Влияние кислотности проверено при оптимальной температуре 30ºС и длительности инкубации 1 час. В таких условиях оптимальное значение pH для фермента липазы соответствует значению 7,55.
Длительность инкубации также влияет на липолитическую активность продуцента. В течение первых 2-х часов активность линейно увеличивается, с 2-х до 3-х часов скорость реакции практически не меняется, после 3-х часов – снижается. Это означает, что до 2-х часов инкубации реакционной смеси фермент липаза функционирует активно и количество образующихся жирных кислот возрастает, а после 3-х часовой выдержки накапливается такое количество продуктов реакции (свободных жирных кислот), которое инактивируют исследуемый фермент липазу.
Рис.1а Зависимость липолитической активности гриба Blakeslea trispora от температуры
Рис.1б Зависимость липолитической активности гриба Blakeslea trispora от рН буфера
Рис.1в Зависимость липолитической активности гриба Blakeslea trispora от длительности инкубации
Для подтверждения правильности сформулированных предположений были проведены дополнительные опыты с внесением олеиновой кислоты и хлористого кальция в реакционную смесь. Получено, что в присутствии 30 мкМ кислоты активность фермента снижалась в 20 раз. В реакционную смесь, содержащую олеиновую кислоту, вносили 35 мкМ хлористого кальция, который, взаимодействуя с кислотой, преобразовывал ее в нерастворимую соль. В результате кислота уже не могла инактивировать липазу, и активность фермента увеличивалась в 1,75 раза. Таким образом, в условиях данного эксперимента выявлено, что внеклеточный фермент липаза гриба Blakeslea trispora наиболее активен при температуре 30ºС, pH среды – 7,55 и длительности реакции не более 3-х часов. По мере развития микробной культуры меняется и активность ферментов [Мюллер, 1995]. Поэтому в работе, также, исследовали влияние возраста культуры гриба Blakeslea trispora на его липолитическую активность при подготовке посевного материала и в условиях периодической ферментации. На рисунке 2 представлена кривая возрастания липолитической активности (+) и (–) штаммов продуцента в посевных аппаратах.
Рис. 2 Зависимость липолитической активности и количества биомассы (+) и (–) штаммов продуцента Blakeslea trispora в посевных аппаратах от длительности культивирования. ЛА – кривая изменения липолитической активности продуцента, Б – кривая накопления биомассы продуцента Blakeslea trispora
Постепенное возрастание липолитической активности гриба начинается с 15 часов от начала выращивания. После 15 и до 25 часов роста активность липазы быстро нарастает. Далее наблюдается снижение скорости нарастания липолитической активности гриба и к концу стадии получения посевной культуры (35-37 часов) липазная активность составляет, в среднем, 10 условных единиц. Усредненная кривая изменения липолитической активности (+) и (–) штаммов посевной культуры гриба соответствует усредненной кривой накопления биомассы в посевных аппаратах, что свидетельствует о первичности метаболизма фермента липазы в данных условиях. С учетом индуцибильности внеклеточного фермента липазы, очевидно, что растительное масло в посевных средах утилизируется не полностью. В связи с этим, возможна рекомендация по уменьшению исходной концентрации масла в составе посевных сред, как для (+) так и для (–) половых штаммов гриба Blakeslea trispora.
Также, анализировали липолитическую активность смешанной культуры продуцента в ходе ферментации. Установлено, что кривая накопления внеклеточного фермента липазы в культуральной жидкости имеет сложный характер (рис.3).
Рис.3 Зависимость липолитической активности и накопления биомассы смешанной культуры продуцента Blakeslea trispora от длительности ферментации. ЛА – кривая увеличения липолитической активности продуцента, Б – кривая накопления биомассы продуцента Blakeslea trispora
Так, в начальный период ферментации липолитическая активность соответствует 1,6 условных единиц. Это объясняется внесением фермента липазы в ферментационную среду вместе с посевной культурой, в которой липолитическая активность находилась на уровне 10 условных единиц. Поскольку посевной материал вносится в ферментационную среду в количестве 15%, то за счет разбавления посевного материала липолитическая активность соответственно снижается. При этом собственная липолитическая активность смешанной культурой еще не наработана. По мере перехода продуцента к активному росту (приблизительно 10-15 часов от начала ферментации) в культуральной жидкости активно накапливается и фермент липаза. Липолитическая активность возрастает до 30-35 часов ферментации и составляет 3,3 условных единиц. После 35-40 часов гриб переходит последовательно в фазу сдерживания роста и стационарную фазу. Биомасса остается на стационарном уровне приблизительно до 70-80 часов. Липолитическая активность постепенно снижается и к 80 часам составляет меньше 2-ух условных единиц, что вероятно свидетельствует об исчерпании растительного масла в среде и снижении его стимулирующего действия на синтез фермента. Однако, около 90 часов ферментации, когда гриб, практически переходит в фазу отмирания, наблюдается резкое возрастание липолитической активности до 3,3 условных единиц. Можно предположить, что биомасса уже частично лизируется и в культуральную жидкость выделяются внутриклеточные липиды, которые и срабатывают как индукторы образования фермента липазы. Данный факт, при определенных технологических доработках, может получить важное прикладное значение, и в одном производственном процессе можно получать два целевых продукта: β-каротин и фермент липазу, имеющие промышленное применение. Оба вещества находятся в разных фракциях культуральной жидкости (биомасса и нативный раствор соответственно), а значит, выделение одного из продуктов не затруднит выделение другого. Так как фермент липаза имеет внеклеточную локализацию, то его выделение и очистка в промышленных условиях значительно облегчается в технологическом и финансовом планах. В таком случае, себестоимость основного продукта β-каротина, значительно снижается. В целом, уровень липолитической активности в посевной культуре значительно выше (приблизительно в 4 раза), чем в смешанной культуре в ферментере. Количество фермента стабильно увеличивается для (+) и (–) штаммов гриба до окончания операций в посевных аппаратах. Это подтверждает мнение об избыточном количестве растительного масла в посевных аппаратах и одновременно указывает на необходимость разностороннего изучения гриба Blakeslea trispora не только как продуцента β-каротина, но и продуцента фермента липазы.
Список литературы
- Патенты по микологии «Blakeslea trispora»
- Деев С.В. Разработка технологии получения жирорастворимых биологических активных веществ из биомассы гриба Blakeslea trispora: Дис… канд. техн. наук: 05.18.10. – М.: 2002. – 186 c.
- Липиды мицелиальных грибов как основа для получения биодизельного топлива / Я. Э. Сергеева, Л. А. Галанина, Д. А. Андрианова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2008. – Т.44. – №5. – С. 576-581.
- Математичне моделювання та оптимізація об’єктів технології неорганічних речовин / Л.А. Фролова, Б.І. Мельников, Ю.Д. Галівець, Н.Б. Мітіна. – Дніпропетровськ: Журфонд, 2010. – 208 с.
- Терёшина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения содержания ликопина и b-каротина // Микробиология. – 1994. – Т.63. – № 6. – С.1111-1116.
- Сергеева Я. Э. О новой функции трегалозы и об особенностях липидообразования у мицелиальных грибов / Я. Э. Сергеева, Л. А. Галанина, Е. П. Феофилова // Микробиология. – 2010. – Т. 79. – №4. – С. 470-474.
- Янышева Н. В. Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403: Дис… канд. хим. наук: 03.00.23. – М.: 2005. – 203 c.
- Мюллер Э. Микология / Э. Мюллер, В.Лёффлер. М.: Мир, 1995. – 343 с.
- Липолититическая активность гриба Blakeslea trispora / С.А. Васильченко, Л.В. Боталкина, Е.В. Васильченко [и др.] // Вопросы химии и химической технологии. – 1989. – Вып. 91. – С. 49-52.
Авторы статьи: Зубарева И.М., к.т.н., доц. каф. биотехнологии и БЖД, УГХТУ; Ляпустина Е.В.
Автор фото в статье: Бондарь И.В.