Целью работы было определение жиров, а также выявления условий благоприятных для накопления их продуцентом. Для опыта с целью сравнения были взяты два микроорганизмы: Candida tropicalis и Lipomyces lipofer. В отличие от первого второй организм является специфичным по активности синтеза жировых включений.
Для получения липидов из исследуемых дрожжей Candida tropicalis и Lipomyces lipofer использовали методики культивирования и определения биомассы; разрушение клеток и отделение балластных веществ; экстрагирование липидов.
Использовали метод световой микроскопии, как один из методов идентификации по морфологическим признакам. Для приготовления препарата пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая его между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.
Если культуру берут с жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.
Далее препарат фиксируют и рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Во фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше окрашиваются.
Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжиривания стекол используют смесь этилового спирта. Эти операции проводят вдали от горелок. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в капли воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см2.
В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, потом мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется во избежание коагуляции белков, искажает структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют. Фиксацию проводят над пламенем горелки. Для этого препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки.
Затем препарат окрашивают. Во время этого мазок помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окраска варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. После окончания окраски препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
Существуют простые и дифференцированные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовой растворах. При этом окрашивается вся клетка.
Для идентификации также применялись текториальные показатели. Для проверки чистоты глубинной культуры дрожжи высевали на сусло-агар и инкубировали в термостате при температуре 28оС. На 2-3 сутки культивирования штамм Candida tropicalis образует круглые кремовые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный — 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое повышение, в среде появляется маленький желто-оранжевую окраску. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая (рисунок 1а). Появления посторонней микрофлоры не наблюдалось.
Рисунок 1 – Фотографии Candida tropicalis, а) вид колоний на плотной среде; б) микрофотография морфологии клеток дрожжей, видно образование псевдомицелия
Морфологически штамм Candida tropicalis представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, чаще одиночные 2-4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10-12 мкм. Наблюдается большое количество бластоспор (рисунок 1б).
Высокоэффективный штамм Lipomyces lipofer ВКПМ Y-1020, который является продуцентом липидов (до 60% от сухой массы). Клетки округлой формы с крупными включениями жира. Почкование многостороннее.
Рисунок 2 – Микрофотография клеток дрожжей Lipomyces lipofer
Культура Lipomyces lipofer способна расти на минеральных средах без источников азота (среда Эшби). Для липидоутворення важно высокое отношение C: N. Старые колонии при сильном Спорообразование темнеют и становятся бурыми или шоколадными (рисунок 2).
Автор статьи: Дохторук Андрей, ст. каф. Микробиология и вирусология, Днепропетровского национального университета им. Олеся Гончара