После разрушения клеточной структуры следующим шагом является выделение целевого продукта с гомогената. Технологический процесс получения микробных липидов, в отличие от получения растительных жиров, обязательно включает стадию глубокого разрушения клеточной структуры и выделения липидов методом экстракции в неполярной растворителе. При этом получают одновременно два готовых продукты: микробный жир (биожир) и обезжиренный белковый препарат (биошрот). Экстракционный способ извлечения жиров полярными растворителями очень взрыво-и пожароопасны.
В идеальном случае процедура экстракции липидов должна приводить к количественному извлечению клеточных липидов в неизмененном виде. Липидный экстракт не должен быть загрязнен нелипидных веществами, такими как сахарами и аминокислотами. Эффективность экстракции липидов в значительной степени зависит от химической природы липидных компонентов и от вида комплексов, образующих липиды в клетке с другими классами природных соединений. Известно три основных типа взаимодействия липидов с другими веществами.
Во-первых, ван-дер-ваальсовы гидрофобное взаимодействие «нейтральных» или неполярных липидов, таких как эфиры стеринов, глицериды, углеводороды, каротиноиды, которое связывает относительно слабыми нековалентными связями их углеводородные цепи с другими липидами или гидрофобными участками белков . Такое взаимодействие осуществляется, в частности, в жировой ткани, комплексах альбумина с жирными кислотами, жировых образованиях микробных клеток и тому подобное.
Во-вторых, образование водородных связей — электростатическое или гидрофобное взаимодействие, при котором полярные липиды (фосфатиды, гликолипиды, холестерин) образуют связи с белками, как это имеет место в плазматических мембранах, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и липопротеинов сыворотки.
В-третьих, образование комплексов, в которых жирные кислоты (нормальные или разветвленные) и оксикислоты связаны ковалентными связями (сложноэфирные, амидные или гликозидными) с полисахаридами, как это имеет место в липополисахариды клеточных стенок бактерий.
С комплексов, образованных в результате ван-дер-ваальсово гидрофобного взаимодействия, липиды можно экстрагировать относительно неполярными растворителями, такими как этиловый эфир, хлороформ или бензол. Липиды, связанные в мембранах, экстрагируют полярными растворителями, такими как этанол или метанол, разрушающих водородные связи и нарушающих электростатическое взаимодействие белков с липидами. Ковалентно связанные липиды не экстрагируются никакими растворителями, их можно выделить лишь расщепив комплекс с помощью кислотного или щелочного гидролиза.
При выборе метода экстракции необходимо учитывать и химическую природу липидов. Обычно, чтобы предотвратить окисление двойных связей, непосредственно перед экстракцией растворители перегоняют и удаляют из них перекиси. Растворители, применяемые для извлечения высоконенасыщенных липидов, следует дезаэрировать, пропуская через них азот, и затем все операции проводить в атмосфере азота. Липидные экстракты не следует ни упаривать насухо, ни оставлять в упаренной виде на долгое время; липиды, извлеченных, надо скорее растворять в соответствующем растворителе. Температура, при которой производится экстракция должна быть не выше комнатной (или ниже, если это необходимо) для того, чтобы затормозить окисление и гидролитическое расщепление липидов. Старые способы экстракции кипящим растворителем в аппарате Сокслета должны быть исключены. Для предотвращения окисления можно добавлять антиоксиданты, наиболее эффективным является например янтарная кислота.
Другой фактор, который следует учитывать, особенно при работе с растительными материалами, это ферментативная деградация липидов при экстракции. Вообще, содержащие спирт смеси растворителей вызывают дезактивацию большинства фосфатидаз и липаз. Стабильные ферменты разрушаются при 1-2 минутном контакте с кипящей водой или горячим спиртом. Однако, некоторые части растений, как, например, зеленые листья, содержат очень стабильный фермент — фосфолипазу D, дезактивировался только при погружении листьев на 1 минуту в кипящую воду или при экстракции кипящим изопропиловым спиртом в течение нескольких минут.
Из вышесказанного следует, что спирт является необходимым компонентом всех смесей, употребляемых для экстракции липидов, поскольку он разрушает комплексы липидов с белками, растворяет липиды и дезактивирует ферменты, вызывающие расщепление липидов. Однако смесь растворителей, содержащих спирт, вместе с липидами экстрагируют нелипидные вещества, содержащиеся в клетках, такие как сахара, аминокислоты, соли и так далее. Поэтому неочищенный липидный экстракт нужно обработать так, чтобы удалить все водорастворимые примеси. Наиболее распространенной процедурой такого рода является промывка экстракта водой, что приводит в некоторых случаях к образованию очень стабильных эмульсий. Увольняют липиды от нелипидных примесей, также пропуская неочищенные экстракты через колонки, заполненные целлюлозой или сефадексом, или проводя диализ через специальные мембраны.
Одним из наиболее часто применяемых и эффективных способов экстракции липидов экстракция по Блай и Дайер — упрощенный вариант методики Фолча. При экстракции по этому методу используют однофазную систему растворителей хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8 по объему), которая быстро и эффективно извлекает липиды. Экстракт разбавляют одним объемом воды и одним объемом хлороформа. В результате образуется двухфазная система, нижний слой которой состоит из хлороформа, а верхний — из смеси метанола и воды (1,0:0,9). Водорастворимые нелипидные примеси переходят в воднометанольний слой, тогда как в хлороформного слое остаются липиды, практически свободны от загрязнений.
Определение содержания жира методом Сокслета, который использовался в ходе выполнения моей бакалаврской работы, основанный на экстрагировании жира из высушенной до постоянной массы навески исследуемой пробы жирорастворителями.
Рисунок – Аппарат Сокслета (состоит из колбы, экстрактора и холодильника)
В ходе работы брали навеску сухого вещества (фильтрат), взвешенную на фильтровальной бумаге размером 6 х 7 см и заворачивали в пакетик. Этот пакетик помещается в другой пакетик с фильтровальной бумаги размером 7 х 8 см. Внутренний пакетик помещают так, чтобы шов не совпадал со швом внешнего пакетика. Приготовленный пакетик помещают в бюкс и высушивают в сушильном шкафу при температуре 103±2°С до постоянной массы. Затем пакетик переносят в экстрактор аппарата Сокслета (рисунок) и заливают смесью хлороформ: метанол (2:1) по методике Фолча. Эфира наливают столько, чтобы он начал переливаться через сифон экстрактора, после чего добавляют еще 50 см3 эфира и соединяют все части прибора. В холодильник пускают холодную воду, а перегонную колбу помещают на водяную баню (температура не выше +45 ° С). Нагрев надо регулировать так, чтобы эфир сливался с экстрактора через каждые 5-6 мин. При непрерывном действии аппарата Сокслета для полного извлечения жира из хорошо измельченной навески нужно 5-6 часов, при плохо измельченной навеске экстракцию необходимо проводить 10-12 часов. Полноту экстракции проверяют на фильтровальной бумаге. Для этого берут 2-3 капли эфира, который вытекает из экстрактора, бумага подогревают. Если на бумаге после испарения эфира не остается масляное пятно, то экстракцию считают законченной. Пакетики вынимают из экстрактора, подсушивают, после чего помещают в бюкс и высушивают в сушильном шкафу при температуре 103±2°С до постоянной массы.
Содержание жира в пробе сухого вещества определяют по формуле (в г / л):
Х=(А-В) / М
где А — масса пакетика с навеской сухого вещества до экстракции жира, г; В — масса пакетика с навеской сухого вещества после экстракции жира, г; М — объем пробы суспензии биомассы дрожжей -10 мл, данные умножали на 100, чтобы узнать сколько г / л образуется жира.
Процесс образования липидов в большинстве дрожжей состоит из двух четко разграниченных стадий:
- Первая стадия характеризуется быстрым образованием белка в условиях усиленного снабжения культуры азота и сопровождается медленным накоплением липидов (в основном глицерофосфатов и нейтральных жиров);
- Вторая стадия характеризуется прекращением роста дрожжей и усиленным накоплением липидов (в основном нейтральных).
Согласно от литературой Candida tropicalis относится по общим содержанием липидов в дрожжей со средним содержанием жиров (от 5 до 15%), а Lipomyces lipofer — с высоким содержанием липидов (> 15%).
Процентное содержание липидов определяли по формуле:
Х= (А-В)*100 / А
где А — количество биомассы до экстракции, г / л; В — количество биомассы после экстракции, г / л.
Автор статьи: Дохторук Андрей, ст. каф. Микробиология и вирусология, Днепропетровского национального университета им. Олеся Гончара