Биотехнологическое производство, в том числе и микробиологическое производство бета-каротина может быть рентабельным только при условии сверхсинтеза целевого продукта, в данном случае, бета-каротина.
Промышленное получение бета-каротина основано на использовании мукорового гетероталлического гриба Blakeslea trispora, биосинтетические процессы у которого необходимо стимулировать.
Повышение активности метаболических путей в клетках гриба достигается различными способами: оптимизацией качественного и количественного состава питательной среды, оптимизацией внешних условий культивирования. Но наиболее эффективным способом интенсификации производства, в целом, является применение специальных стимуляторов каротиногенеза, что обеспечивает значительное увеличение выхода целевого продукта без дополнительных затрат сырьевых и энергетических ресурсов.
В качестве стимуляторов каротиногенеза у Blakeslea trispora изучены различные природные и синтетические соединения, их смеси, микробные массы различного происхождения, отходы цитрусовых культур и др. Наибольшее влияние на синтез каротиноидов смешанной культурой гриба Blakeslea trispora оказывает бета-фактор – половой гормон гриба. Выход бета-каротина в присутствии бета-фактора (триспоровой кислоты) возрастает в 20-25 раз.
Получать триспоровые кислоты в чистом виде затруднительно, поскольку синтезируются они в клетках гриба в очень низких концентрациях. А, значит, выделение такого вещества, как индивидуального препарата технологически сложно и экономически не выгодно. Поэтому применение бета-фактора в промышленном производстве, на сегодняшний день не возможно.
Обнаружены различные синтетические аналоги триспоровых кислот, наиболее эффективным среди которых оказался бета-ионон.
На сложных маслосодержащих средах присутствие этого биостимулятора увеличивает выход бета-каротина в 3-4 раза по сравнению с контролем. Механизм действия бета-ионона сводится к стимуляции ферментов, участвующих в биосинтезе каротиноидов. Механизм срабатывает на уровне трансляции белков на рибосомах. Причем, в молекулу бета-каротина бета-ионон не включается. Это означает, что бета-ионон выступает стимулятором каротиногенеза, но не является предшественником каротиноидов.
Таким образом, поиск стимуляторов каротиногенеза бета-иононового ряда остается актуальным. Как потенциальные стимуляторы могут рассматриваться разные производные иононов. Так, имеются противоречивые сведения о стимулирующем действии альфа-ионона.
Различие в химической структуре альфа- и бета-иононов заключается только в положении двойной связи в циклической части молекулы (рис.1 а, б).
Рис. 1. Структурная формула химических изомеров ионона
Поэтому, возможно предположить наличие стимулирующих каротинообразование свойств также и у альфа-ионона.
В связи с этим, целью данной работы является сравнительное изучение влияния альфа- и бета-иононов на развитие смешанных культур гриба Blakeslea trispora в условиях глубинного периодического культивирования.
Материалы и методы
Для проведения исследований использовали смешанную культуру мукорового гриба Blakeslea trispora, представленного (+) 64 и (–) 490 штаммами.
Посевной материал получали пересевом обеих форм с музейных косяков на рабочие, содержащие сусло-агаровую питательную среду. Оптимальный срок выращивания рабочей культуры 7 суток. В течении двух последних суток, рабочая культура гриба освещалась солнечным светом с целью усиления спорообразования. Последующий пересев посевного материала гриба проводился на жидкую кукурузно-соевую питательную среду в качалочные колбы объемом 250 мл.
Продолжительность раздельного культивирования гриба в маточных колбах на качалках 3 суток. Режим перемешивания 220-240 об/мин.
Совместное выращивание обеих форм продуцента (ферментация) проводили в колбах вместимостью 250-300 мл. на качалках, работающих в режиме 220-240 об/мин. в течении 5 суток. Ферментационная среда имеет следующий состав (%): кукурузная мука – 4,7; соевая мука – 2,3; дигидрофосфат калия – 0,05; тиамин гидрохлорид – 2·10-4. Кукурузная и соевая мука предварительно поддавались слабокислотному гидролизу. Температура культивирования на всех стадиях – 24-26ºС. Питательные среды стерилизовали в автоклаве. Режим тепловой обработки 1,25 атм в течении 45 минут.
Стимуляторы каротиногенеза вносили в культуральную жидкость на стадии ферментации смешанной культуры гриба в концентрациях от 50 до 2500 мкг/мл, предварительно растворив их в подсолнечном (кукурузном) масле. Время внесения стимуляторов 48 ч. от начала ферментации. Выход биомассы и бета-каротина определяли по известным методикам.
Опыт выполняли в 10 повторах. Полученные результаты, обрабатанные методом математической статистики [Фролова, 2010], представлены графически.
Рис. 2. Зависимость выхода бета-каротина от концентрации бета-ионон
Рис. 3. Зависимость выхода бета-каротина от концентрации альфа-ионона
Рис. 4. Зависимость выхода бета-каротина от концентрации смеси альфа- и бета-ионона
Рис. 5. Зависимость выхода биомассы гриба от концентрации альфа-ионона
Рис. 6. Зависимость выхода биомассы гриба от концентрации бета-ионона
Рис. 7. Зависимость выхода биомассы гриба от концентрации смеси альфа- и бета-ионона
Полученные результаты свидетельствуют, что присутствие в культуральной жидкости альфа- и бета-иононов и их смеси в указанных концентрациях, влияют как на выход биомассы гриба, так и на биосинтетическую активность (выход бета-каротина). В интервале исследуемых концентраций стимулятора выявлено, что различные количества иононовых веществ и их смесей оказывают различное действие на интенсивность роста и на каротиногенез смешанной культуры.
По мере повышения концентраций бета-иононов от 50 мкг/мл до 500 мкг/мл количество бета-каротина интенсивно увеличивается, о чем свидетельствует характер кривой выхода бета-каротина. Дальнейшее увеличение количества бета-ионона в культуральной жидкости (от 500 мкг/мл до 1500 мкг/мл) не обеспечивает еще большей активации каротиногенеза грибом, и кривая располагается параллельно оси абсцисс. Еще большее количество бета-ионона (от 1500 до 2500) угнетают процесс синтеза каротиноидов у Blakeslea trispora. Активность культуры по каротину довольно резко снижается и при концентрации 2500 мкг бета-ионона в мл культуральной смеси достигает 53 мг бета-каротина в 100 мл КЖ, то есть выход бета-каротина снижается практически в 2 раза.
Таким образом, выход бета-каротина, в присуцтвии 500-1500 мкг иононов в 1 мл КЖ, увеличивается в 4,5 раза, по сравнению с контролем. В контрольные среды бета-ионон не вносился.
Действие изомерного вещества альфа-ионона подобно стимулирующему влиянию бета-ионона. Кривая выхода бета-каротина от концентрации альфа-ионона подобна зависимости накопления бета-каротина от концентрации бета-ионона. Вероятно, механизмы активирующего действия исследуемых иононовых веществ сходны между собой.
Значительно более эффективным оказалось комбинированное действие альфа- и бета-иононов. На биосинтетическую активность продуцента выявлена общая закономерность действия смеси иононов веществ и каждой из них по отдельности. Характеры приведенных кривых подобны и различаются только количественно. Так, смесь равных комбинаций альфа- и бета-иононов увеличивает выход бета-каротина в 1,4 раза по сравнению с одним альфа-иононом или бета-иононом. Больший стимулирующий эффект смеси иононовых веществ объясняется, вероятно, синергетическим действием их на каротиногенные структуры и системы Blakeslea trispora.
Обратное влияние оказывает присутствие стимуляторов на ростовые процессы у исследуемого продуцента бета-каротина. Так, и альфа- и бета-ионы подавляют накопление биомассы грибам. При постепенном увеличении концентрации бета-ионона (до 1500 мкг/мл) количество биомассы постепенно снижается и составляет чуть более 80% по сравнению с контролем, когда стимулятор не вносится в культуральную среду. Дальнейшее возростание количества бета-ионона увеличивает скорость ингибирования мицелиальной массы Blakeslea trispora. При концентрации бета-ионона 2500 мкг/мл накапливание биомассы снижается почти в 1,4 раза относительно контроля.
Кривые влияния альфа-ионона и смеси обоих изомеров на рост гриба проходят параллельно охарактеризованной кривой для бета-ионона. Но в присутствии альфа-ионона абсолютное значение биомассы продуцента несколько ниже, чем в присутствии бета-ионона в среде культивирования. Совместное действие смеси иононовых веществ на накопление биомассы имеет наибольшее ингибирующее действие.
Таким образом, подтверждено стимулирующее действие альфа-ионона на процесс каротиногенеза у Blakeslea trispora. Это означает, что структурные различия в молекулах альфа- и бета-иононов не влияют на способность их активизировать биосинтетические процессы в клетках продуцента. Наибольшее стимулирующее действие выявили смеси обоих иононовых веществ в концентрации 500 до 1500 мкг/мл. Следовательно, необходим поиск доступных источников иононовых веществ. При этом нет необходимости разделять изомеры на отдельные фракции. Однако мицелий продуцента негативно реагирует на присутствие каждого иононового вещества в отдельности. Совместное же присутствие обоих иононов имеет наиболее отрицательное влияние на рост гриба. Но, поскольку активировать каротинообразующие системы Blakeslea trispora необходимо, то следует снизить негативное действие иононов на биомассу гриба. Например, определить и оптимизировать время введения иононовых стимуляторов в КЖ.
Автор фото (Blakeslea trispora) в статье: Бондать И.В.
Авторы статьи: к.т.н., доцент каф. биотехнология и БЖД УГХТУ Зубарева И.М., Ляпустина Е.В.