Получение ферментов осуществляется двумя способами поверхностным и глубинным. Поверхностный способ культивирования для получения ферментов применяется в основном для культивирования микроскопических грибов. В его основе выращивание микроорганизмов на твердых (реже жидких), рыхлых питательных средах; при глубинном культивировании – микроорганизмы выращиваются в толще жидких питательных сред. В этих условия можно культивировать как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы.
Технологический процесс получения ферментов при поверхностном культивировании микроорганизмов – продуцентов состоит из следующих основных стадий: получение посевного материала, приготовление питательной среды, выращивание культуры микроорганизма, сушка культуры или выделение из культуры очищенных препаратов ферментов.
Получение ферментов. Стадия 1 – получение посевного материала
Для промышленного получения ферментных препаратов из микроорганизмов, выращиваемых в поверхностных условиях, в качестве посевного материала используют культуру микроскопических грибов, выращенную на твердой питательной среде, а также споры (конидии) и мицелиальную массу продуцента, выращенного в глубинных условиях на жидкой питательной среде. Для получения посевной культуры на твердой питательной среде используют увлажненные пшеничные отруби. Среда должна быть рыхлой. С этой целью к отрубям добавляют 5-10% древесных опилок или 10-15% солодовых ростков. После стерилизации в течении часа при 0,15 МПа влажность питательной среды составляет 35-60%. Питательную среду охлажденную до 35°С, засевают суспензией конидий (500-600 тыс. конидий в 1 мл на 10-15 г отрубей), а затем раскладывают слоем 10-15 см по стерильным посевным кюветам. Закрытые кюветы со средой помещают в растильные камеры, где поддерживают определенную влажность и температуру. Для большинства микроскопических грибов в первые сутки роста поддерживается температура 28-32°С, влажность 70-95%; во вторые – 26-30°С, влажность 60-85%, в третьи – 24-26°С, влажность 55-64%. Максимум образования конидий приходится на 72-85 часы роста. После этого посевные кюветы выдерживают ещё 72-96 ч при температуре 8-10°С. Просохшая культура может сохранять способность к прорастанию конидий в течении 15-20 суток.
Споровый посевной материал может быть получен из подсушенной культуры. Для этого культура гриба подается в вибросепаратор, где отделяются споры (конидии). С помощью вакуума они поступают в приемник, предварительно проходя через сетчатый фильтр. Такой споровый материал может храниться в течении 1,5 лет при температуре 8-24°С.
Получение ферментов. Стадия 2 – Приготовление питательной среды
Основным компонентом питательной среды для выращивания микроскопических грибов рода Aspergillius поверхностным способом служат пшеничные отруби, для Tr. roseum – продуцента цитолитических ферментов – зерновая шелуха и солодовые ростки. Для штамма Aspergillius awamori 16 при получении пектолитических ферментов необходим свекловичный жом. Используется смесь состоящая из 70 % свекловичного жома – (источник пектина) и 30 % пшеничных отрубей. Нередко используется картофельная мезга и пивная дробина – отходы предприятий пищевой промышленности. Для получения рыхлой структуры к средам добавляют древесные опилки (5 – 10 %), за исключением дубовых, солодовые ростки (15 – 20 %), овсяную шелуху. Пшеничные отруби содержат необходимые для роста и развития микроорганизмов питательные вещества, в том числе незаменимые аминокислоты метионин (19 %), триптофан (0,3 %) и лизин (0,6 %), 16 – 20 % крахмала, 10 – 12 % белка, до 4 % жира, различные фосфорные соединения, минеральные соли, микроэлементы и некоторые другие вещества. Подготовка твердых питательных сред для выращивания микроорганизмов состоит в том, что пшеничные отруби, солодовые ростки, опилки, как правило, смешивают в стерилизаторе (50 – 60% по объему) и полученную смесь перед стерилизацией увлажняют до 20 – 40 % влажности. Стерилизаторы рассчитаны на работу при температуре от 104 до 140°С при избыточном давлении 0,03 МПа. Вместимость стерилизаторов колеблется от 300 до 500 кг. Для получения высокоактивных культур существенное значение имеет начальная влажность питательной среды. Она обычно колеблется в пределах 58 – 60 %. При повышении влажности среды ухудшается аэрация растущей культуры, а при понижении замедляется рост мицелия и снижается активность синтезируемых ферментов. В производственных условиях к концу цикла выращивания влажность снижается до 35 – 40 % даже несмотря на поддержание относительной влажности воздуха близкой к 100 %.
Получение ферментов. Стадия 3 – Выращивание культуры продуцента в производственных условиях
В простерилизованную и охлажденную до температуры 40°С питательную среду при непрерывном перемешивании вносят посевной материал и стерильную воду с таким расчетом, чтобы конечная влажность подготовленной среды была 58 – 60%. Засеянную конидиями чистой культуры грибов или глубинной посевной культурой питательную среду раскладывают слоем 2 – 3 см в кюветы или в вертикальные кассеты толщиной 4 – 5 см. Выдерживают обычно при температуре 28 – 32 °С в течении 22 – 40 ч в специальных растильных камерах или механизированных установках. Готовая культура в кюветах подается к дробилке. В растильных камерах на 1 м объема приходится (по сухой массе) от 8 до 18 кг
отрубей. Микроорганизмы культивируют при строго определенных условиях температуре, аэрации, влажности. Общая длительность культивирования составляет, например, для Aspergillius oryzae 30 – 36 ч, для Aspergillius awamori (продуцент амилазы) – 36 – 42 ч, Aspergillius awamori (продуцент пектиназы) – 46 – 48 ч, для Aspergillius terrikola – 44 – 48 ч, для Asp. foetidus – 48 – 52 ч. Кондиционирование воздуха, идущего на аэрацию, осуществляют в кондиционерах. В главном кондиционере воздух, забираемый из атмосферы, подогревают и охлаждают в зависимости от времени года до температуры 22 – 24 °С. Затем частично воздух обеспложивается на васциновом и ватном фильтрах и поступает в индивидуальные кондиционеры. В них очищенный воздух подогревается в калорифере до температуры 30°С и увлажняется паром до влажности, близкой к 100 %.
Рециркулирующий в системе воздух проходит следующую обработку: забранное воздухом тепло при прохождении через камеру (установку для выращивания) снимается на воздухоохладителе, затем воздух из главного кондиционера смешивается с 10 % свежего воздуха, доводится до требуемых параметров и вновь поступает в камеру или установку для выращивания. Отработанный воздух выбрасывается в атмосферу, предварительно пройдя масляные и бактериальные фильтры. Для предохранения растильной камеры от попадания необеспложенного воздуха в ней создается небольшое избыточное давление. В процессе роста микроскопические грибы потребляют 25-35% сухих веществ среды и в результате диссимиляции выделяют в окружающую среду большое количество тепла и диоксида углерода. Если избыточное тепло не удалять из растильных камер, культура подсыхает, снижается ее ферментативная активность и даже прекращается развитие. Максимальное тепловыделение растущей культурой длится 1-2 ч и составляет к массе исходных отрубей 335-377 кДж/кг. Для отвода такого большого количества тепла проводят интенсивное вентилирование растильных камер кондиционированным воздухом. Кондиционирование воздуха преследует несколько целей: очистку от пыли и посторонней микрофлоры, поддержание определенной температуры, насыщение влагой до содержания, близкого к 100 %. Проходя через растильные камеры, воздух контактирует с растущей культурой гриба, при этом нагревается на 2 – 3°С и становится менее насыщенным влагой, поэтому он способен поглощать воду из более нагретой массы растущей культуры, вызывая подсыхание питательной среды.
Получение ферментов. Стадия 4 – Сушка культуры
Выгружаемая из растильной камеры или установки для выращивания готовая культура микроскопических грибов представляет собой брикет (корж) влажностью от 35 до 58 %, в котором частицы питательной среды (отруби, зерновая шелуха) связанны с мицелием. Это неустойчивый продукт, в результате выделяющегося тепла ферменты почти полностью могут инактивироваться в течении 3 ч. Для сохранения культуры в активном состоянии в течении длительного времени ее необходимо высушить до влажности 10-13%. Для интенсификации процесса сушки культуру гриба измельчают на различных дробилках, дезинтеграторах до частиц размером 2-3 мм. К этим машинам предъявляются особые требования. При дроблении культура гриба во избежание инактивации фермента не должна разогреваться, распыление ее должно быть минимальным, и получаемые гранулы должны иметь определенную величину.
Для сушки культуры используют сушилки ленточные, шахтные вибрационные, прямоточные непрерывного действия и др. Скорость сушки зависит от многих факторов: химического состава среды, влажности, температуры, скорости движения сушильного агента (обычно воздуха), разности температуры на входе и выходе из сушилки и др. Основным условием успешного высушивания является максимальное сокращения длительности пребывания культуры гриба в сушилке до 5-8 мин при температуре продукта на выходе не больше 40-42°С, что снижает потери активности до минимума. Высушенную культуру гриба фасуют в крафт — мешки по 18-30 кг. Сухая культура микроскопических грибов товарный продукт.
Автор статьи: ст. гр. БТ, УГХТУ, Кириченко К.
На фото культура Aspergillius.