Промышленные способы производства ликопинсодержащей биомассы гриба Blakeslea trispora — натурального сырья для получения ликопина, дефицитного пищевого красителя, обладающего ценной биологической активностью
Несмотря на то, что синтетические пищевые красители по-прежнему занимают лидирующие позиции во многих отраслях пищевой промышленности, современные тенденции рынка пищевых красителей показывают постоянно увеличивающийся спрос на натуральные красители. Ограничения использования и уменьшения числа искусственных красителей, в том числе и правовые, связаны с тем, что они не обладают питательной ценностью и могут быть потенциально опасны как аллергены и канцерогены, в то время как, красители натурального происхождения, помимо красящих свойств, обладают рядом уникальных биологических функций.
Так, бета-каротин (желто-оранжевый пигмент моркови) и ликопин (красный пигмент томатов), наиболее известные и широко используемые пищевые красители натурального происхождения, в настоящее время рассматриваются как ценные и универсальные биологические соединения – являются антиоксидантами, антимутагенами, радиопротекторами и иммуномодуляторами, и в связи с этим приобретают самостоятельное значение, как биологически активные добавки и фармакологические субстанции. Результаты многочисленных исследований последних лет показывают, что среди каротиноидов ликопин обладает наиболее высокой биологической активностью и целым набором важных фармакологических свойств, связанных, прежде всего с его антиоксидантной способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в клетках. Ликопин стабилизирует иммунную систему, улучшает липидный обмен, нормализует уровень глюкозы в крови и показывает высокую эффективность при лечении опухолей, особенно рака простаты, легких, молочной железы, а также атеросклероза и ишемической болезни сердца.
Дефицит на рынке и высокая стоимость натурального ликопина объясняются тем, что традиционный способ его получения из растительного сырья, специально отселекционированных сортов томатов Lycopersicon sp., имеет ряд характерных недостатков, специфических для такого рода продуктов: сезонность, действие погодных факторов и фитопатогенов, а главное – низкий выход целевого продукта (0,3-0,4 мг/г сырья). Учитывая постоянно растущие потребности в ликопине, исследования по поиску новых источников и промышленных способов его получения представляются особенно актуальными. Решение перечисленных проблем возможно только путем создания эффективных биотехнологических способов. Многие виды микроорганизмов способны синтезировать каротиноиды в минимальных количествах, способностью к сверхсинтезу бета-каротина и ликопина обладает только один вид низших грибов, нашедший практическое применение — Blakeslea trispora. Совместно культивируемые (+) и (-) штаммы этого гриба могут расти на относительно дешевых средах, достаточно быстро накапливать биомассу и синтезировать каротиноиды в значительных количествах.
В последовательной цепочке биосинтеза бета-каротина, где бета-каротин является конечным продуктом, ликопин выполняет функцию предшественника, из которого затем синтезируются все другие каротиноиды. Получение ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гриба Blakeslea trispora, возможно двумя основными, принципиально различными способами. По первому способу – на основе ликопинсинтезирующих штаммов (мутантов, полученных методами классического химического мутагенеза), у которых происходит целенаправленный биосинтез ликопина. По второму способу – на основе каротинсинтезирующих штаммов, у которых происходит целенаправленный биосинтез бета-каротина, но, при введении в состав ферментационной среды или на режиме культивирования различных ингибиторов фермента ликопинциклазы, процесс биосинтеза останавливается на стадии образования ликопина и происходит частичное или полное подавление синтеза бета-каротина.
По первому способу в «Госниисинтезбелок» (Москва, Россия, 2002г.) была разработана лабораторная технология получения биомассы ликопина без введения ингибиторов ликопинциклазы на основе культивирования штаммов ВСБ 129 (-) и ВСБ 130 (+) на минеральных средах, использование которых в условиях промышленного производства нецелесообразно, т.к. являются дорогостоящими. Выход целевого продукта составил 0,8г/л ликопина при низком съёме по биомассе. По второму способу на «Уралбиофарме» (Екатеринбург, Россия, 2000г.) была разработана промышленная технология получения биомассы ликопина с введением в состав среды ингибиторов ликопинциклазы – аминоэтилпиридина или табачной крошки – на основе культивирования штаммов 8А(-) и 8А(+) на кукурузно-соевых средах. Способ не получил промышленного развития, к недостаткам следует отнести незначительный выход целевого продукта 0,4-0,7г/л ликопина и высокую токсичность используемых ингибиторов.
В настоящее время ООО «НПП «ВИТАН» (Днепропетровская область) является единственным в Украине и на территории стран СНГ промышленным предприятием производителем биомассы натуральных каротиноидов (бета-каротин, ликопин, фитоин) на основе культивирования различных штаммов грибаBlakesleatrispora. В 2004-2008 г.г. на базе научно-производственной лаборатории предприятия были проведены исследования по разработке способов получения ликопинсодержащей биомассы. В настоящее время отработано 3 различных способа, по которым проведены производственные испытания и получены опытные промышленные партии новых видов ликопинсодержащей продукции.
Первый способ заключается в получении ликопинсодержащей биомассы на основе ликопинсинтезирующих штаммов ЛК1 без использования ингибиторов ликопинциклазы. Для этой технологии основные исследования были направлены на разработку состава ферментационных сред, способов подготовки посевного материала, выявление оптимальных параметров культивирования. Технический результат по данному способу показывает, что содержание ликопина в культуральной жидкости достигает 0,7-1,5 г/л при накоплении биомассы 15-20 г/л, массовая доля ликопина в высушенной биомассе составляет 2-3,5%. Готовый продукт содержит 97-99% ликопина и минимальные количества бета-каротина – 0,1-1% от суммы каротиноидов. К недостаткам этого способа следует отнести относительно низкие съёмы по биомассе, к преимуществам – значительное преобладание ликопина.
Второй способ заключается в получении ликопинсодержащей биомассы на основе каротинсинтезирующих штаммов ТКСТ с использованием ингибитора ликопинциклазы – имидазола. Для этой технологии направления исследований состояли в определении оптимальной концентрации имидазола, кратности, времени и способа введения. Технический результат данного способа – содержание ликопина в культуральной жидкости достигает 1,0-2,0г/л при накоплении биомассы 20-25 г/л, массовая доля ликопина в высушенной биомассе составляет 3-4,5%. Готовый продукт содержит 70-90% ликопина и 10-30% бета-каротина от суммы каротиноидов. Преимущества данного способа заключаются в значительном увеличении съёмов по биомассе и ликопину. К недостаткам использования имидазола следует отнести:
- с биосинтетической точки зрения, имидазол обладает неполным ингибирующим эффектом на ликопинциклазу, что приводит к существенному остаточному количеству бета-каротина в получаемой биомассе, имидазол оказывает некоторое ингибирующее влияние на синтез биомассы и каротиноидов в целом;
- с технологической точки зрения, имидазол при однократном введении не обеспечивает необходимой ингибирующей активности, необходимо 3,4-х-кратное введение на режиме ферментации, что значительно повышает риск инфицирования культуральной жидкости;
- с финансовой точки зрения, являясь дорогостоящим продуктом, имидазол проявляет выраженную ингибирующую активность в диапазоне концентраций 0,08-0,16%, это составляет 5-10кг в расчете на ферментацию в биореакторе геометрическим объёмом 10м3, что приводит к значительному удорожанию ликопинсодержащей биомассы.
Дальнейшие исследования были направлены на подбор наиболее эффективных ингибиторов ликопинциклазы из некоторых групп азотсодержащих гетероциклических соединений: пятичленные гетероциклы (имидазолы), шестичленные гетероциклы (пиридины) и группы аминов. По результатам исследований установлено, что наиболее высокой активностью ингибирования ликопинциклазы является 2-метилимидазол, обладая рядом преимуществ перед имидазолом, таких как:
- оказывает ингибирующее действие в диапазоне концентраций от 0,0025 до 0,025%, что может составлять от 170г до 1,7кг в расчете на ферментацию, что позволяет значительно снизить себестоимость ликопинсодержащей биомассы;
- обладает слабо выраженным ингибирующим действием на синтез биомассы, что позволяет увеличить съёмы по биомассе с операции ферментации;
- не требует многократного введения на режиме ферментации, оптимальный вариант – однократное введение в состав ферментационной среды до стерилизации;
- проявляет высокую активность ингибирования ликопинциклазы и наиболее полное подавление синтеза бета-каротина, при оптимальных вариантах в синтезируемом продукте содержится 100% ликопина от суммы каротиноидов при полном отсутствии бета-каротина.
По третьему способу, с использованием ингибитора ликопинциклазы — 2-метилимидазола, технический результат показывает содержание ликопина в культуральной жидкости 1,5-2,5г/л при накоплении биомассы 25-30 г/л, массовая доля ликопина по ферментации 5-9%, в высушенной биомассе 4-7%. Готовый продукт содержит 85-100% ликопина и 0-15% бета-каротина. Разработанный третий способ получения ликопинсодержащей биомассы объединил преимущества первого (значительное преобладание ликопина) и второго (значительное увеличение съёмов по биомассе и ликопину) способов, отработанных ранее.
Таким образом, в настоящее время на ООО «НПП «ВИТАН» разработаны и успешно освоены 3 различные технологии промышленного производства ликопинсодержащей биомассы, получены новые виды дефицитной продукции с различными характеристиками и высоким содержанием ликопина, столь необходимого человеческому организму. Данные биотехнологические способы являются экономически и технологически оправданными и позволяют получать ликопин природного качества.
Источник: Промышленные способы производства ликопинсодержащей биомассы гриба Blakeslea trispora — натурального сырья для получения ликопина, дефицитного пищевого красителя, обладающего ценной биологической активностью / Кунщикова Е. А. // Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика: тези доповідей IV Міжнародної науково-практичної конференції (Дніпропетровськ, 11 – 13 листопада 2008 р.) – Дніпропетровськ, 2008. – С. 36-38.