Вплив амінокислот на розвиток гриба Blakeslea trispora продуценту бета-каротину / І.М. Зубарева, О.В. Ляпустіна
Вивчена здатність гриба Blakeslea trispora розвиватися і синтезувати b-каротин на поживних середовищах, що містять у якості джерела азоту кукурудзяний екстракт. Показано, що утилізація грибом окремих амінокислот, присутніх у кукурудзяному екстракті, різна. Рекомендовано застосовувати лейцин і фенілаланін для стимуляції зростання міцелію, а аланін і тирозин – для стимуляції каротиногенезу у гетероталлічного гриба Blakeslea trispora. Відзначено, що у гриба Blakeslea trispora ні по одній з вивчених амінокислот не проявилася ауксотрофність.
Ключові слова: Blakeslea trispora, b-каротин, амінокислота, кукурудзяний екстракт, джерело азоту.
Effect of aminoacids on the development of fungus Blakeslea trispora as b-carotene producer/ I.M. Zubareva, O.V. Liapustina
The ability of the fungus Blakeslea trispora develop and synthesize b-carotene in culture media containing, as nitrogen source, corn steep liquor was investigated. Shown that the utilization of individual aminoacids by the fungus present in corn steep liquor, are different. Recommended to use a leucine and phenylalanine for stimulation of the growth of the mycelium, and alanine and tyrosine – for stimulation of carotenogenesis in the fungus Blakeslea trispora. Noted that the fungus Blakeslea trispora none of the studied aminoacids did not appear auxotrophic.
Keywords: Blakeslea trispora, b-carotene, aminoacid, corn steep liquor, a source of nitrogen.
Изучена способность гриба Blakeslea trispora развиваться и синтезироватьb-каротин на питательных средах, содержащих в качестве источника азота кукурузный экстракт (смесь аминокислот). Показана способность утилизации грибом отдельных аминокислот, присутствующих в кукурузном экстракте и отсутствие ауксотрофности по всем изученным аминокислотам.
Введение
Актуальным является поиск новых источников сырья для создания лечебных, лечебно-профилактических препаратов, пищевых и кормовых добавок. Таким источником могут служить мицелиальные грибы, способные синтезировать широкий комплекс веществ белковой, липидной природы, витамины и другие физиологически активные соединения [3]. Особый интерес представляют продуценты липофильных биоантиоксидантов, среди которых, один из наиболее перспективных – гетероталлический гриб Blakeslea trispora [9]. Штаммы Blakeslea trispora являются сверхпродуцентами бета-каротина и ликопина [1,13,14,15] и,кроме того, возможен биосинтез других ценных соединений терпеноидной природы – убихинонов, эргостерина [5,6]. Микробиологический синтез бета-каротина является наиболее оправданным промышленным способом его производства как с технологической, так и с экономической точек зрения [12]. Промышленным продуцентом является смешанная культура (+) и (–) штаммов Blakeslea trispora. Производственная схема включает несколько последовательных стадий. Для каждой стадии разрабатываются различные по качественному и количественному составу питательные среды: среды для хранения музейных и пересева рабочих культур, посевные и ферментационные среды. Существуют базовые и универсальные питательные среды, но универсальное не означает лучшее. Проблема оптимизации процесса культивирования и состава питательной среды для каждого вида продуцента и для каждого случая вообще остается актуальной. В состав питательных сред входят источники углеродного и азотного питания, последний может быть органическим или неорганическим. Для Blakeslea trispora известно, что наибольшее увеличение роста мицелия наблюдается на питательных средах с применением органического азотного питания, а именно белка и продуктов его гидролиза [11]. Показа возможность развития гриба Blakeslea trispora на питательных средах с использованием органических кислот (уксусной и пировиноградной) в качестве углеродного питания [8]. Питательные среды, оптимизированные по источнику азота, обеспечивают высокий выход биомассы мицелиального продуцента Blakeslea trispora, чем и способствуют оптимизации всего промышленного синтеза пигмента бета-каротина. Однако влияние отдельных аминокислот и их сочетания на развитие продуцента изучено не достаточно. В состав питательной среды может входить кукурузный экстракт (ТУУ 18.243-95) как источник азота, содержащий смесь свободных аминокислот. Химический состав экстракта зависит как от сорта кукурузы, так и от условий ее выращивания, а также от технологии получения основных продуктов и условий хранения экстракта. В табл. 1 приведен аминокислотный состав кукурузного экстракта [7].
В связи с этим целью данной работы является исследование аминокислотного метаболизма мукорового гриба Blakeslea trispora и определение влияния аминокислот – как компонентов питательной среды на процессы роста и каротинообразования у исследуемого продуцента.
Материалы и методы
Объектом исследования является гетероталлический гриб Blakeslea trispora. Материалом исследования служили (–) 490 и (+) 64 совместимые половые формы данного гриба. Ферментацию проводили в лабораторных условиях по общепринятой методике [4]. Основной питательной средой для культивирования гриба Blakeslea trispora является среда, содержащая в качестве источника азотного питания 4,1% кукурузного экстракта, углеводного питания – 4,5% зеленой патоки. Культивирование осуществлялось на протяжении 5 суток в качалочных колбах объемом 250 мл, при частоте перемешивания 220–240об/мин и температуре 260С.
По окончании ферментации в культуральной жидкости определяли содержание бета-каротина, аминокислот и биомассы гриба Blakeslea trispora по известным методикам [13]. Число повторов исследования составило 10. Полученные результаты обрабатывали методом математической статистики [10].
Результаты и их обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют, что активный рост гриба Blakeslea trispora, а значит, и накопление биомассы завершается к 40 ч ферментации (рисунок). Это указывает на окончание, так называемой, трофофазы в развитии продуцента и переход его, через короткую фазу сдерживания роста, в стационарную фазу развития, в течение которой количество биомассы остается постоянным, и которая завершается к 80–85 ч от начала ферментации. Начало активного каротиногенеза приходится на конец трофофазы (40 часов) и длится до окончания стационарной фазы (до 90 ч). Характер кривой накопления b-каротина указывает на вторичность метаболизма данного провитамина (рисунок).
Общее содержание аминокислот определяли в исходной питательной среде и в культуральной жидкости по ходу и по окончании ферментации. Установлено, что гриб поглощает 65–70% смеси аминокислот от их исходного количества в питательной среде. При этом, в процессе активного роста, до 40 ч, продуцентом утилизируется 45–50% всех аминокислот среды. Вероятно, утилизируемые грибом аминокислоты расходуются на построение клеточных белковых структур. Остальные 20% расходуются в период стационарной фазы развития гриба Blakeslea trispora. В этот же период времени в клетках гриба Blakeslea trispora начинается синтез b-каротина. Поскольку аминокислоты непосредственно не участвуют в биосинтезе каротиноидов, то можно предположить, что они необходимы для поддержания физиологической активности мицелия, для синтеза каротинсинтезирующих ферментов и каротинсвязывающих белков. Потребность в аминокислотах у гриба Blakeslea trispora снижается практически вдвое по мере старения культуры.
Некоторые свободные легкоусваиваемые аминокислоты могут выступать ингибиторами роста и специфических метаболических реакций у грибов [2]. Поэтому в данной работе изучили способность гриба Blakeslea trispora усваивать аминокислоты, присутствующие в исходной питательной среде в составе кукурузного экстракта. Установлено, что гриб поглощает все имеющиеся в среде аминокислоты, но скорость и интенсивность утилизации отдельных аминокислот различна. Это означает, что потребность продуцента в различных аминокислотах неодинакова в целом и на разных стадиях развития культуры. Данное утверждение подтверждается изменением концентраций аминокислот в ходе ферментации. За 100 ч культивирования грибом Blakeslea trispora поглощается приблизительно 40–50% аргинина и лизина, 50–70% гистидина, аспарагиновой кислоты, глутамина и треонина, 70–90% аланина, изолейцина, валина, метионина, пролина, серина, тирозина и фенилаланина (табл. 2) от исходного значения в питательной среде на момент начала культивирования.
Большее поглощение аминокислоты может свидетельствовать об ее большей востребованности грибом, как во время наращивания биомассы, так и во время каротинобразования. Характер усвоения отдельных аминокислот отличается от выявленных выше закономерностей. Валин и лейцин расходуются грибом только в трофофазу, на конец которой валин поглощается на 74%, а лейцин – на 82%, далее содержание этих аминокислот сохраняется неизменным (табл. 2). Цистин, присутствующий в небольшом количестве в исходной питательной среде, полностью поглощается грибом к началу стационарной фазы и используется для синтеза собственных клеточных белков, и поэтому, в свободном виде аминокислота в мицелии не определяется. (табл.2).
Очевидно, также, что количество аминокислот, поглощенных грибом не соответствует количеству аминокислот в выросшем грибном мицелии. Как правило, уровень поглощения аминокислот продуцентом выше, чем уровень включения их в клеточные белки. Это наблюдается для аланина, валина, гистидина, метионина, пролина. Количество этих аминокислот, поглощенных грибом, в 1,5–2,0 раза выше, чем их содержание, обнаруживаемое в мицелии. Данный вывод подтверждает мнение о том, что в клетках грибов существует два фонда аминокислот: из одного аминокислоты расходуются на синтез белка, из другого (резервного) – для других последующих биосинтезов [2]. По таким аминокислотам, как глутамин, лейцин и лизин ситуация обратная. Анализируя количество глутамина в исходной питательной среде, в культуральной жидкости и в мицелии к концу ферментации, обнаружено, что в мицелии количество глутаминовой кислоты приблизительно в 4,5 раза превышает его количество в исходной питательной среде, и в 7,5 раз превышает количество данной аминокислоты поглощенной грибом за время ферментации. Аналогично для лейцина, превышение количества которого в мицелии относительно исходного содержания в питательной среде составило 23%, а относительно количества, поглощенного грибом – 50%. Содержание лизина в мицелии не превысило содержания данной аминокислоты в исходной питательной среде, однако превысило количество аминокислоты, поглощенное грибом, на 21%. Это может свидетельствовать о синтезе этих аминокислот грибом de novo. Количество таких аминокислот как аспагаригиновая кислота, серин, треонин, изолейцин, тирозин, фенилаланин и аргинин, поглощенное из питательной среды, равняется содержанию этих аминокислот в биомассе. В таком случае, вероятно, происходит прямая ассимиляция (непосредственная утилизация) указанных аминокислот. Характер усвоения таких аминокислот как аланин, валин, гистидин, метионин, пролин, поглощение которых, превысило включение их в мицелий гриба, свидетельствует об их необходимости для поддержания физиологической активности мицелия, для синтеза каротинсинтезирующих ферментов и каротинсвязывающих белков.
Таким образом, большинство из имеющихся в исходной питательной среде аминокислот не поглощается полностью. Можно предположить, что наиболее пригодными для роста мицелия являются те аминокислоты, которые максимально поглощаются во время трофофазы, так как расходуются на ростовые процессы, связанные с наращиванием биомассы гриба. Таковыми являются аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин и фенилаланин, поглощение которых превысило 70% от исходного содержания в питательной среде. Наименьшее влияние на ростовые процессы, оказывает аргинин, так как его поглощение составило 26% от исходного содержания в питательной среде. Максимальное поглощение аминокислоты грибом в трофофазу наблюдалось для лейцина – 82% и фенилаланина – 85%, что отмечает их особую необходимость во время накопления биомассы. На протяжении стационарной фазы в культуральной жидкости содержание лейцина не изменялось, а фенилаланина изменялось, но не значительно (поглотилось 16% от его содержания в культуральной жидкости на начало стационарной фазы), что указывает на непричастность этих аминокислот к процессу каротинообразования. Вероятно, что для стимуляции процесса каротинообразования продуценту необходимы те аминокислоты, которые интенсивно утилизируются грибом во время стационарной фазы. Поглощение таких аминокислот как аланин, аспарагиновая кислота, глутамин и тирозин превысило 30% от их содержания в культуральной жидкости на начало стационарной фазы. Остальные аминокислоты утилизировались в меньшей степени, особенно лизин и треонин, поглощение которых не превысило 10% от их содержания в культуральной жидкости на начало стационарной фазы. Максимальное поглощение аминокислоты грибом в стационарную фазу наблюдалось для аланина – 35% и тирозина – 33% от их содержания в культуральной жидкости на начало стационарной фазы, что может свидетельствовать об их первоочередной необходимости для протекания каротиногенеза.
При разработке промышленных штаммов сверхпродуцентов микроорганизмы могут утрачивать природную способность к синтезу отдельных метаболитов [14]. В результате микроорганизмы из протрофных по определенному веществу превращаются в ауксотрофные по соответствующему метаболиту. В наибольшей степени ауксотрофность проявляется у микроорганизмов по отдельным аминокислотам. В связи с этим гриб Blakeslea trispora также проверили на ауксотрофность по аминокислотам, присутствующим в составе среды. Для этого использовали искусственные питательные среды, в которых кукурузный экстракт был заменен на смесь свободных аминокислот. Такие среды рассматривали как контрольные. Опытные среды включали все аминокислоты из перечня кроме одной. При наличии ауксотрофности по отсутствующей аминокислоте гриб не смог бы выжить на подобной обедненной среде. Но свойство ауксотрофности гриба Blakeslea trispora, в условиях данного исследования, не было обнаружено, ни по одной из аминокислот.
Вывод
Таким образом, гриб Blakeslea trispora способен развиваться и синтезироватьb-каротин на питательных средах, содержащих в качестве источника азота кукурузный экстракт. Утилизация грибом отдельных аминокислот, входящих в состав кукурузного экстракта, различна. Установлено, что лейцин и фенилаланин являются наиболее необходимыми для роста мицелия, а аланин и тирозин – для стимуляции каротиногенеза у гетероталлического гриба Blakeslea trispora. Такие аминокислоты как аланин, валин, гистидин, метионин, пролин необходимы для поддержания физиологической активности мицелия, для синтеза каротинсинтезирующих ферментов и каротинсвязывающих белков. Отмечено, что у гриба Blakeslea trispora ни по одной из изученных аминокислот не проявилась ауксотрофность.
Список литературы
1. Авчиев М.И., Буторова И.А., Авчиева П.Б. Изучение особенностей роста и накопления ликопина парой гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-130(+) и ВСБ-129(-) // Біотехнологія. – 2003. – № 3. – С.12-19.
2. Билай В.И. Основы общей микологии. – К.: Вища шк., 1980. – 360 с.
3. Биохимический состав биомассы гриба Blakeslea trispora / О.В. Калинкевич, А.Н. Калинкевич, В.Д. Чиванов, В.И. Киндя // Природничий альманах. – 2009. – № 13. – С.39-49.
4. Васильченко С.А., Зубарева И.М., Федорова И.С. Влияние питательных сред на рост и каротиногенез Blakeslea trispora // Мікробіологічний журн. – 1993. – Т.55. – № 4 – С.31-36.
5. Деев С.В., Буторская И.А., Авчиева П.Б. Выделение убихинонов из биомассы гриба Blakeslea trispora // Биотехнология. – 2000. – № 5. – С.36-46.
6. Деев С.В., Буторская И.А., Авчиева П.Б. Синтез и выделение эргостерина при использовании в качестве продуцента гриба Blakeslea trispora // Біотехнологія. – 2000. – № 4. – С.22-31.
7. ЕлиновН.П. Основы биотехнологии. – СПб.: Наука, 1995. – 600 с.
8. Зубарева И.М., Кузнецова О.В. Влияние отдельных органических кислот на метаболизм каротинсинтезирующего гриба Blakeslea trispora // Вісник ДНУ. Сер. Біологія. Екологія. – 2001. – Т.9. – № 1 – С.184-186.
9. Кіндя В.І.Перспективи використання біологічно активних речовин біомаси Blakeslea trispora в аграрному секторі України // Біотехнологія. Освіта. Наука: Тез. доп. І Всеукр. наук.-практ. конф. – К.: Наука, 2003. – С.112-113.
10. Математичне моделювання та оптимізація об’єктів технології неорганічних речовин / Л.А. Фролова, Б.І. Мельников, Ю.Д. Галівець, Н.Б. Мітіна. – Дніпропетровськ: Журфонд, 2010. – 208 с.
11. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология: Пер. с нем. – М.: Мир, 1995. – 343 с.
12. Сааков В.С. Альтернативные пути биосинтеза каротиноидов у Procaryota и Eucaryota // Докл. АН России. – 2003. – Т.392. – № 6. – С.825-831.
13. Терёшина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения содержания ликопина и бета-каротина // Микробиология. – 1994. – Т.63. – № 6. – С.1111-1116.
14. Терёшина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. Состав липидов у мукорового гриба Blakeslea trispora в условиях стимуляции ликопинообразования // Микробиология. – 2010. – Т.79. – № 1. – С.39-44.
15. Mantzouridoua F., Tsimidou M. Z. On the monitoring of carotenogenesis by Blakeslea trispora using HPLC // Food Chemistry. – 2007. – Vol.104. – № 1. – P.439-444.
Источник: Зубарева И. М. Влияние аминокислот на развитие гриба Blakeslea trispora продуцента бета-каротина / И. М. Зубарева, Е. В. Ляпустина // Вопросы химии и химической технологи. – 2010. – № 6. – С. 37-41
Читайте также статьи по теме «Производство и значение бета-каротина»:
- Микробиологический синтез бета-каротина грибом Blakeslea trispora на крохмалсодержащих средах
- Бета-каротин и каротиноиды
- Бета-каротин и витамин А
- Каротин. Изомеры каротина
- Каротин. Применение
- Каротин. Усвоение
- Каротин: продуценты, промышленный синтез и использование
- Каротиноиды
- Книга Гиннесса по каротиноидам