Этанол производится методом сбраживания сахаров (глюкозы, сахарозы и других) в бескислородной среде спиртовыми дрожжами. Раньше почти весь этанол, изготовленный таким путем, использовался для производства алкогольных напитков, и лишь небольшие объемы, полученные химическими методами, применялись в промышленности. За последние 25 лет ситуация коренным образом изменилась. Этанол — экологически чистое топливо, что дает при сгорании СО2 и Н2О. Он используется в двигателях внутреннего сгорания в чистом виде или как 10-20%-ая добавка к бензину (газохол). В Бразилии уже к 1996 г. 75% автомобилей работали на 95%-ом этаноле, а другие — на газохол. В США предполагают заменить на этанол 10% потребляемого бензина. На значительных посевных площадях намечают выращивать сельскохозяйственные культуры, предназначенные для биотехнологической переработки в этанол. В условиях дефицита посевных площадей возникает проблема, которая уже в наши дни актуальна для Бразилии и выражается дилеммой: продовольствие или энергия. Производство этанола из растительного сырья не является безотходным: на каждый литр спирта расходится 12-14 л сточных вод с высокой концентрацией отходов, опасных для природных экосистем. Проблема рациональной переработки этих отходов не решена.
Промышленный процесс брожения может осуществляться по различным схемам: непрерывно, периодически и периодически с возвратом биомассы. При периодическом процессе субстрат сбраживается после внесения свежо выращенного инокулята, который обычно получают в аэробных условиях. После завершения сбраживания субстрата клетки продуцента отделяют, и для нового цикла получают свежий посевной материал. Это достаточно дорогостоящий процесс, поскольку в аэробном процессе размножения дрожжей расходуется много субстрата. Экономический выход в процессе составляет около 48% от субстрата по массе (часть субстрата расходуется на процессы роста и метаболизма клеток, а также образование других продуктов – уксусной кислоты, глицерола, высших спиртов).
Если как продуцент в процессах брожения используют дрожжи производительность составляет 1-2 г этанола / г клеток в час. На лабораторном уровне при использовании как продуцент бактериальной культуры Zymomonas mobilis эта величина выше практически в 2 раза. В промышленных процессах производительность аппаратов сильно зависит от физиологических особенностей продуцента, плотности биомассы, типа аппарата и режима ферментации; варьирует очень широко, от 1 до 10 г / л в час. Продолжительность цикла составляет около 36 часов, конечная концентрация спирта – 5% (вес / объем).
Недостатки процесса (главным образом, продолжительность и неполное использование субстрата) можно частично устранить, применяя процесс с повторным использованием биомассы. По этой схеме выход спирта можно увеличить до 10 г / л час.
При реализации непрерывного процесса полнота использования субстрата в основном зависит от интенсивности процесса, то есть скорости протока. Однако при этом возникают противоречия между двумя параметрами, по которым обычно оптимизируют брожение: конечный выход спирта и полнота использования сахаров. После окончания процесса брожения концентрация спирта в браге может составлять от 6 до 12%. Чем выше конечная концентрация спирта, тем менее энергоемкая стадия перегонки. Так, при 5% концентрации спирта расхода пара для получения 96% спирта составляют более 4 кг / л при содержании спирта в браге около 10% – эта величина сокращается до 2,25 кг / л.
Побочными продуктами спиртового брожения является углекислота, сивушные масла, кубовые остатки, дрожжи. Каждый из этих продуктов имеет определенную стоимость и самостоятельную сферу применения.
Классическими биообъектами, используемыми при получении спирта, являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae (см. рис.1).
Рисунок 1 – Saccharomyces cerevisiae (электронная фотография и флуоресценция клеток под действием специальных красителей)
Дрожжи имеют ряд недостатков:
- Конкуренция брожения и дыхания. Субстрат (например, глюкоза) частично сбраживается до этанола. Оставшаяся, безвозвратно теряется, превращаясь в результате дыхания в СО2 и Н2О. Процесс необходимо вести в анаэробных условиях или применять мутанты дрожжей, которые потеряли митохондрии и не способны к дыханию.
- Чувствительность к этанолу, которая снижает выход целевого продукта на единицу объема биореактора. Получены устойчивые к этанолу мутанты, характеризующиеся измененным строением клеточных мембран.
- Отсутствие ферментов, катализирующих расщепление крахмала, целлюлозы, ксилана. Необходим предварительный гидролиз субстрата или засев биореактора смешанной культурой, содержащей, помимо Saccharomyces cerevisiae, микроорганизмы с соответствующей гидролитической активностью.
Бактерия Zymomonas mobilis, (рис. 2) (еще применяют штаммы Zymomonas anaerobica, Sarcina ventriculi, Clostridium thermocellum) применявшейся американскими индейцами для сбраживания сока агавы, эффективно сбраживает сахарозу и устойчива к этанолу. Дальнейшее повышение устойчивости Zymomonas mobilis к этанолу достигается добавлением в среду инкубации Mg2+ и ряда нуклеотидных компонентов.
Рисунок 2 – Zymomonas mobilis
Термофильные бактерии, продуценты этанола характеризуются высокой скоростью роста и метаболизма, чрезвычайно стабильными ферментами, необычной для остальных бактерий устойчивостью к этанолу (до 15% и более). Термофилы способны к биоконверсии полисахаридных субстратов в этанол. Так, Thermoanaerobium brockii сбраживает крахмал, Clostridium thermocellum — целлюлозу, Clostridium thermohydrosulfuricum утилизирует продукты деградации целлюлозы с очень высоким выходом спирта. Перспективно применение экстремально термофильного продуцента спирта Thermoanaerobacter ethanolicus. Планируется использование также ацидофильных (оптимум рН 1,5) и галофильных продуцентов спирта.
Повышение выхода спирта и стабилизация активности его продуцентов могут быть достигнуты путем иммобилизации клеток. Так, эффективный синтез этанола осуществлен с применением клеток Zymomonas mobilis, иммобилизованных на хлопковых волокнах (S. Prentis).
Материал статьи любезно предоставил Дохторук Андрей, ст. каф. Микробиология и вирусология, Днепропетровского национального университета им. Олеся Гончара