Были проведены лабораторные исследования спиртового брожения виноградного сусла. В качестве объекта исследования был использован культурный виноград вида Vitis labrusca, сорт Лидия. Для постановки опыта по спиртному брожению на первом этапе была проведена подготовительная работа. Сначала виноград тщательно осмотрели, отделили некачественные ягоды (подгнившие, заплесневевшие). 1000 г винограда промыли проточной водой. Было проведено микроскопирование смытой воды. Микроскопия показала наличие в препаратах незначительного количества клеток дрожжей лимоновидной формы (предположительно р. Hanseniaspora, Kloeckera), а также бактерий сферической и цилиндрической формы, в том числе подвижных. Выявляются также гифы плесневых грибов.
После тщательной промывки грозди ягоды отделили от гребней. Далее в эмалированной кастрюле ягоды раздробили, а полученную мезгу профильтровали через ватно-марлевый фильтр. Сусло-самотек вместе с отжатой вручную фракцией сусла составило 600 мл (60%). Отжатая мезга (жом) в дальнейшем не используется.
Полученное сусло проанализировали на соответствие необходимым микробиологическим требованиям. Прямое микроскопирование показало незначительное количество клеток микроорганизмов в поле зрения (1-5), что соответствует стандартным требованиям.
Второй этап — процесс брожения виноградного сусла при различных температурных режимах. Виноградное сусло не подвергалось стерилизации и забродило спонтанно на естественном микрофлоре.
Колбы с суслом закрыли гидрозатворами, колбу № 1 оставили при комнатной температуре (16±2°С), колбу № 2 поставили в термостат с температурой 30°С.
Ход брожения сусла контролировали пикнометрическим методом. Метод основан на определении относительной плотности сусла до и во время брожения. Поскольку в процессе сбраживания углеводов образуется спирт, то плотность сбраживаемого сусла всегда меньше плотности исходного сусла. По специальной таблице определяют количество спирта, образовавшегося и несброженные углеводы. Плотность бродящего сусла измерили через определенные промежутки времени.
Визуальная оценка процесса спиртового брожения указывает на то, что в колбе с суслом № 1 процесс происходит гораздо интенсивнее, о чем свидетельствует активное выделение пузырьков углекислого газа. В колбе с суслом № 2 выделение углекислого газа немного, и микроскопические образцы сусла № 2 показывают наличие в нем более широкого спектра микроорганизмов. Но при дальнейшем протекании процесса, с увеличением кислотности, посторонняя микрофлора при такой кислотности погибает.
Дальнейшие микробиологические анализы проводились каждые 3-5 дней, в течение которых констатировался рост популяции винных дрожжей.
Как видно из результатов исследования, повышенная температура существенно интенсифицирует процесс брожения: при 30°С уже на третьи сутки в термостате перебродило около 80% первоначального сахара. За этот же период при комнатной температуре интенсивность брожения составила всего 18%.
Параллельно через определенные промежутки времени проводили микробиологический контроль бродящего сусла.
Таблица 1 – Результаты контроля спиртового брожения виноградного сусла пикнометрическим методом
| Сутки анализа | Плотность виноградного сусла, г/см3 | Спирт % | Сброженный сахар, % | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 18оС | 30оС | 18оС | 30оС | 18оС | 30оС | |
| 1 | 1,1046 | 1,1071 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 3 | 1,0941 | 1,0561 | 1,05 | 7,60 | 1,55 | 12,85 |
| 4 | 1,0834 | 1,0299 | 2,34 | 11,10 | 4,00 | 18,70 |
| 6 | 1,0532 | 1,0178 | 6,40 | 12,65 | 10,85 | 21,30 |
| 10 | 1,0409 | 1,0149 | 8,00 | 12,99 | 13,50 | 21,90 |
| 11 | 1,0354 | 1,0146 | 8,70 | 12,99 | 14,70 | 21,90 |
| 12 | 1,0052 | 12,65 | 21,35 | |||
| 15 | 1,0050 | 12,65 | 21,35 | |||
По результатам расчета были построены кинетические кривые сбраживания виноградного сусла при различных температурных режимах.
Рисунок – Кинетика спиртового брожения виноградного сусла
Уже на следующий день после постановки опыта по брожению микроскопический анализ показал увеличение количества дрожжевых клеток лимоноподобной формы (Kloeckera арiculata) в виноградном сусле № 1, некоторые из клеток размножаются почкованием. Наблюдались также мелкие клетки продолговатой формы (Hansenula anomala), однако дрожжевые клетки лимоноподобной формы преобладали (90%). Мертвых клеток практически нет. В препарате также видные игольчатые кристаллы фосфата кальция — рафиды из клеточного сока ягод винограда.
Наличия бактерий не зафиксировано, вероятно из-за кислой реакцию виноградного сусла (рН=3).
В то же время в пробе № 2 (температура 30°С) уже на вторые сутки начался процесс интенсивного спиртового брожения. Физиологическое состояние дрожжевых клеток (70% размножающихся почкованием) соответствует экспоненциальной фазе роста. В препарате уже наблюдаются отдельные крупные клетки овальной формы (предположительно р. Saccharomyces).
На восьмые сутки в сусле № 2 процесс спиртового брожения завершился. В колбе № 1 спиртовое брожение закончилось за две недели. При комнатной температуре процесс спиртового брожения проходит примерно в 2 раза дольше.
Полученное модельное вино (виноматериал) после окончания брожения вновь проанализировали с целью определения состояния дрожжей, а также наличие посторонней микрофлоры.
В виноматериалев № 2, полученном сбраживанием сусла в термостате, преобладали сахаромицеты — преимущественно старые клетки с зернистой цитоплазмой, толстой оболочкой. Прижизненная окраска показала 60-70% мертвых клеток. В препарате с виноматериала № 1 наблюдалась смешанная культура: вместе с мелкими лимоновидными и удлиненными цилиндрическими клетками наблюдались крупные овальные и круглые клетки дрожжей Saccharomyces (около 50%). Посторонняя бактериальная микрофлора отсутствует. Этому способствует не только низкий уровень рН, но и значительная концентрация образовавшегося в результате брожения спирта (12%).
По органолептическим свойствам виноматериал № 2 (полученный при 30°С) имеет светло-золотистый цвет, приятный аромат и вкус, характерный для полусухого белого вина, без посторонних тонов. Виноматериал № 1 вышел сухим, более темного оттенка, причем он отличался некоторым фруктово-эфирным привкусом. Возможно, эта разница в качестве объясняется тем, что при разных температурных режимах работают различные дрожжи. В частности, как показали результаты микроскопического исследования в сусле № 1 на протяжении всего процесса сбраживания преобладали «дикие дрожжи» Hanseniaspora арiculata, которые отличаются от культурных дрожжей большей скоростью размножения при низких температурах. Продукты их метаболизма угнетают размножение культурных винных дрожжей. Вследствие повышения содержания летучих кислот и эфиров вино получает нежелательный аромат.
Таким образом, в результате размножения и жизнедеятельности дрожжей в анаэробных условиях виноградное сусло превращается в вино. При этом часть углеводов служит материалом для спиртового брожения, часть расходуется на дрожжегенерацию. Более гармоничный виноматериал получен при низкой температуре. Несмотря на существенное ускорение брожения, по нашему мнению, нет смысла таким образом интенсифицировать процесс производства вина по причине ухудшения качества.
Общее количество продуктов спиртового брожения и соотношение отдельных компонентов зависит от расы дрожжей и условий брожения — температуры, концентрации сахара, аэрации, рН среды и т.д. Под влиянием различных факторов количество вторичных продуктов спиртового брожения (глицерин, ацетальдегид, сивушные масла, органические кислоты, эфиры) может меняться.
Наибольшее участие в спиртовом брожении виноградного сусла принимает Saccharomyces сеrevisiae (vini), однако на первой стадии и в середине процесса ферментации значительная роль принадлежит видам дрожжей, не относящихся к сахаромицетам.
В начале брожения (до накопления 2-4% спирта) развивается Kloeckera арiculata, Hansenula anomala, Hanseniaspora арiculata, Candida krusei и др. Содержание этих дрожжей растет с 104-108 кл / мл в конечной популяции. Такое увеличение количества несахаромицетов, несомненно, оказывает влияние на химический состав и качество вин. Затем среду усваивают дрожжи рода Saccharomyces и до конца брожения виды несахаромицетов практически не проявляются. Чаще всего в настоящее время выделяются Saccharomyces сеrevisiae и Saccharomyces oviformis. Другие виды сахаромицетов находятся в небольших количествах. Считают, что такая смена видов, называется аменсализмом (подавление роста одного вида из-за присутствия токсичного субстрата, производимого другим видом), обусловлена разной способностью дрожжей производить спирт и чувствительностью к нему.
Автор статьи: ст. каф. Биотехнология и БЖД «УГХТУ » Иванущик А.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.